發(fā)布時間：2020-11-15 22:43

　　 研究背景:急性心�？蓪е滦募〖毎诙虝r間內(nèi)缺血壞死,并引起心臟功能減退以及心力衰竭的發(fā)生。促進原位心肌細胞增殖再生以代替丟失心肌細胞為目標的再生醫(yī)學一直以來都是醫(yī)學界研究熱點。新生小鼠心尖切除后能夠完全再生,但是這種再生能力在出生后7天就會丟失。PDGFR-β作為一種酪氨酸酶受體,能夠將細胞外的信號傳導到細胞內(nèi)并啟動增殖、代謝、遷移等生物過程。PDGF信號通路的缺失會導致室間隔缺損、晚期胚胎心室發(fā)育擴張、冠狀動脈血管平滑肌細胞發(fā)育障礙、心室致密化不全等心臟畸形;但是對于PDGF信號通路在哺乳動物心臟再生中作用的研究甚少。研究結果:一、PDGFR-β信號通路在促進小鼠心肌細胞增殖及心臟再生中發(fā)揮了關鍵作用1.為了分析PDGFR-β信號通路是否與小鼠出生后心肌再生能力丟失存在聯(lián)系,我們分離不同年齡(1天、4天、7天、14天、28天及56天)小鼠心肌細胞,提取蛋白進行Western Blot定量檢測;發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長,PDGFR-β在心肌組織中的表達逐漸下降,其磷酸化水平也相應降低。為了探討PDGFR-β信號與心肌再生的相關性,我們構建1天齡小鼠心尖切除模型,發(fā)現(xiàn)新生小鼠心肌損傷后7天心肌組織中PDGFR-β蛋白表達水平和磷酸化水平均明顯升高。如上結果提示,PDGFR-β信號通路在新生小鼠心肌再生過程中可能發(fā)揮了重要作用。2.為了探究PDGFR-β信號通路在心肌再生中的作用,我們將PDGFR-βD849V/fl小鼠與Myh6-Mercre Mer小鼠雜交,構建了Tamoxifen誘導型心肌細胞特異性PDGFR-β持續(xù)磷酸化激活的小鼠(簡稱為:β-D849V)。7天齡(小鼠心肌組織再生能力丟失的時間點)β-D849V小鼠冠脈前降支結扎構建心梗模型,心梗后21天超聲檢測心功能發(fā)現(xiàn):相較野生型C57小鼠心梗而言,β-D849V小鼠有更好的心功能(EF值存在顯著性差異),Masson染色進一步提示β-D849V小鼠能夠有效減小心梗纖維化病灶面積。與野生型小鼠相比,β-D849V小鼠心梗后7天的心肌組織切片中α-actinin與Ki67、p H3、Ed U等多種心肌細胞增殖指標共染細胞比例顯著增加。由此證明,特異性激活新生小鼠心肌細胞中的PDGFR-β信號通路能夠誘導心梗區(qū)心肌細胞增殖,促進心肌組織再生,改善心功能。二、PDGFR-β信號通路通過促進EZH2表達水平調(diào)控小鼠心肌細胞增殖及心肌再生1.我們分離1天齡PDGFR-βD849V/fl小鼠原代心肌細胞,體外培養(yǎng)后利用Ad-CMV-Cre病毒感染細胞持續(xù)激活PDGFR-β信號通路表達。病毒感染48h后,PDGFR-β信號通路激活組(Ad-CMV-Cre)細胞α-actinin與Ki67、p H3、Ed U等多種增殖指標共染細胞比例顯著高于對照組(Ad-CMV-Null);體外實驗進一步確認PDGFR-β信號通路能夠促進心肌細胞增殖。為了揭示PDGF信號促進心肌再生的分子機制,我們將PDGFR-β信號通路激活組及對照組的心肌細胞進行了RNA測序(RNA-Seq);經(jīng)生物信息學分析發(fā)現(xiàn),蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶(Enhancer of zeste homolog 2,EZH2)的表達水平在PDGFR-β信號通路激活組的心肌細胞中顯著升高,q RT-PCR實驗也驗證了這一結果。如上實驗提示,PDGFR-β信號通路可能通過促進EZH2表達水平參與心肌細胞增殖能力的調(diào)節(jié)。2.為了確定EZH2與心肌再生是否存在關聯(lián),我們構建了1天齡小鼠心尖切除損傷再生模型,術后7天取材檢測EZH2表達水平,發(fā)現(xiàn)在心肌再生過程中EZH2的表達水平會顯著上調(diào);如上結果提示EZH2可能與心肌再生相關。為了確定EZH2在小鼠心肌再生中的作用,我們將EZH2fl/fl小鼠與Myh6-Mercre Mer小鼠雜交,構建EHZ2心肌特異性敲除小鼠(EZH2-c KO);手術制作1天齡小鼠心尖切除模型,術后心臟取材免疫熒光檢測心肌損傷后再生過程中心肌細胞的增殖情況(術后7天)和超聲心動圖檢測及Masson染色檢測心肌組織再生情況(術后21天)。結果提示,EZH2心肌細胞特異性敲除后導致心肌細胞增殖能力顯著下降(Ki67、p H3、Ed U陽性的心肌細胞減少),原本可以完全再生的1天齡小鼠心肌組織發(fā)生纖維化,術后21天心功能變差。由此證實,EZH2在新生小鼠心肌再生過程中發(fā)揮了關鍵作用。3.為了證明PDGFR-β信號通路促進心肌細胞增殖與心肌再生是通過調(diào)控EZH2來實現(xiàn)的。我們把EZH2c KO小鼠β-D849V小鼠雜交,構建心肌細胞特異性過表達PDGFR-β信號、同時在心肌細胞中特異性敲除EZH2的小鼠(β-D849V;Ezh2c KO)。7天齡β-D849V;Ezh2c KO小鼠構建心梗模型,術后用免疫熒光、Masson染色、心臟超聲的技術分析其心肌再生能力,結果表明:EZH2敲除會導致PDGFR-β促進心肌再生的能力丟失。由此證實,PDGFR-β信號通路促進心肌細胞增殖及心肌組織再生是通過上調(diào)EZH2表達來實現(xiàn)的。4.為了探究PDGFR-β促進EZH2表達水平的分子機制,我們分離1天齡PDGFR-βD849V/fl小鼠原代心肌細胞,Ad-CMV-CRE腺病毒感染表達Cre酶激活PDGFR-β信號通路,48h后Western-Blot檢測PDGF相關下游靶通路,包括:MAPK/Erk、PI3K/Akt、PLCγ等表達與磷酸化水平。結果表明,PDGFR-β信號持續(xù)激活可觸發(fā)P-Akt磷酸化。P-Akt抑制劑(LY294002)處理PDGFR-β信號通路激活的心肌細胞(Ad-CMV-CRE感染)會導致EZH2的表達水平無法上調(diào),且心肌細胞增殖能力被顯著抑制。由此證實,激活的PDGFR-β是通過Akt/PI3K信號通路促進EZH2表達進而影響心肌細胞增殖。5.為了闡明EZH2促進心肌細胞增殖的分子機制,我們分別用H3K27me3(EZH2發(fā)揮作用的靶蛋白)和SUZ12(EZH2發(fā)揮作用的蛋白復合體PRC2成員之一)的抗體開展Ch IP實驗,捕獲受到PRC2-H3K27me3調(diào)控的靶基因Ink4a/Arf,進行q RT-PCR檢測。結果表明,EZH2敲除后H3K27me3對Ink4a/Arf轉錄抑制調(diào)控顯著下降,上調(diào)表達的Ink4a/Arf作為細胞增殖抑制因子,最終導致心肌細胞增殖能力減弱。由此證實,EZH2催化H3K27me3修飾,從而抑制Ink4a/Arf轉錄最終促進心肌再生。結論:通過如上實驗,我們獲得了如下結論:1)證實了PDGFR-β信號通路在心肌細胞增殖與心肌組織再生中發(fā)揮了關鍵作用;2)通過RNA測序技術檢測出EZH2介導了PDGFR-β信號通路調(diào)控心肌細胞增殖的過程,并證實EZH2是心臟再生能力維持的關鍵分子;3)PDGFR-β信號通路調(diào)節(jié)心肌細胞中AKT/PI3K的磷酸化,促進EZH2表達;EZH2作為PRC2蛋白復合體成員催化H3K27me3修飾,抑制細胞周期阻遏分子Ink4a/Arf上調(diào),實現(xiàn)了對心肌細胞增殖和心肌組織再生能力的調(diào)控。這一研究,為解析哺乳動物心肌再生分子機制提供了新的科學依據(jù);為心肌再生干預手段開發(fā)提供了新的潛在靶點。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R541
【部分圖文】：

結果一、檢測不同年齡段小鼠心肌組織PDGFR-β通路表達。有研究表明，1 天齡的乳鼠心肌損傷后 21 天能夠完全增殖再生，但這種能力在出生后 7 天丟失，損傷的心肌細胞不能完全再生。為了分析 PDGFR-β 信號通路是否與小鼠出生后心肌再生能力丟失存在聯(lián)系，我們分離不同年齡（1 天、4 天、7 天、14 天、28 天及 56 天）小鼠心肌組織，提取蛋白后進行 Western Blot 定量檢測 PDGFR-β信號通路表達改變；結果顯示：隨著年齡的增長，PDGFR-β 在心肌組織中的表達逐漸下降，其磷酸化水平發(fā)生顯著降低，在 7-14 天年齡這個時間點尤為明顯（圖 1 A，B），而這個下降的時間點恰好與心臟再生能力丟失時間點相一致。已有研究證實，隨著年齡的增長，胰腺細胞增殖能力下降與 PDGF 受體的表達降低存在聯(lián)系。據(jù)此，我們推測心肌再生能力丟失可能與 PDGFR-β 表達下降相關。

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文為了探究 PDGF 信號通路是否參與到新生小鼠心肌損傷再生過程中，我們對 1天齡小鼠構建心尖切除模型后的心尖部分組織樣本進行了 Western-Blot 檢測PDGFR-β 信號通路表達改變，發(fā)現(xiàn)新生小鼠心肌損傷后 7 天心肌組織中 PDGFR-β 表達水平明顯上調(diào)，磷酸化水平明顯升高（圖 2 A，B）。為了進一步證實 PDGFR-β 在心肌組織中激活，我們利用 RNA 原位雜交（RNAscope ）技術在心肌切片組織中檢測Pdgfr-β基因表達情況。結果顯示，在心肌組織中新生小鼠心尖切除術后4天Pdgfr-βmRNA 轉錄水平明顯高于假手術組，在切口位置尤其明顯（圖 2 D）。免疫組化染色（IHC）結果表明，心肌組織中心肌細胞磷酸化 PDGFR-β 表達水平相比于假手術組心肌組織中明顯升高（圖 2C）。因此，我們證實 PDGFR-β 信號通路在新生小鼠心尖切除后再生過程中的心肌細胞中存在激活現(xiàn)象。二、新生小鼠心肌細胞損傷后PDGFR-β通路表達升高

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文為了探究 PDGF 信號通路是否參與到新生小鼠心肌損傷再生過程中，我們對 1天齡小鼠構建心尖切除模型后的心尖部分組織樣本進行了 Western-Blot 檢測PDGFR-β 信號通路表達改變，發(fā)現(xiàn)新生小鼠心肌損傷后 7 天心肌組織中 PDGFR-β 表達水平明顯上調(diào)，磷酸化水平明顯升高（圖 2 A，B）。為了進一步證實 PDGFR-β 在心肌組織中激活，我們利用 RNA 原位雜交（RNAscope ）技術在心肌切片組織中檢測Pdgfr-β基因表達情況。結果顯示，在心肌組織中新生小鼠心尖切除術后4天Pdgfr-βmRNA 轉錄水平明顯高于假手術組，在切口位置尤其明顯（圖 2 D）。免疫組化染色（IHC）結果表明，心肌組織中心肌細胞磷酸化 PDGFR-β 表達水平相比于假手術組心肌組織中明顯升高（圖 2C）。因此，我們證實 PDGFR-β 信號通路在新生小鼠心尖切除后再生過程中的心肌細胞中存在激活現(xiàn)象。二、新生小鼠心肌細胞損傷后PDGFR-β通路表達升高
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