目的心肌纖維化(Cardiac fibrosis,CF)是心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后心肌重構(gòu)的發(fā)生過程,與心力衰竭密切相關(guān)。已表明雙調(diào)蛋白(Amphiregulin,AR)與其他臟器纖維化發(fā)生相關(guān)。但目前AR與MI后CF之間的關(guān)系仍不明確。因此,本研究主要探討AR與MI后CF之間的關(guān)系及具體分子機(jī)制。方法和結(jié)果1、MI后心臟巨噬細(xì)胞分泌AR。1)建立小鼠MI模型,應(yīng)用Elisa、WB、RT-PCR及IF技術(shù)發(fā)現(xiàn)第7天時(shí)梗死邊緣區(qū)、血液及心臟巨噬細(xì)胞中AR表達(dá)明顯增高;2)體外TGF-β1刺激巨噬細(xì)胞后,RT-PCR及WB技術(shù)表明TGF-β1激活巨噬細(xì)胞MAPK通路導(dǎo)致AR分泌。2、AR誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化。1)體外AR刺激BMDMs后巨噬細(xì)胞M2極化并分泌TGF-β1,此外,WB技術(shù)表明EGFR通路被激活,用EGFR抑制劑處理后TGF-β1表達(dá)明顯下調(diào);2)收集AR刺激BMDMs后的細(xì)胞上清(CM)與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),WB、RT-PCR、IF及Transwell小室技術(shù)發(fā)現(xiàn)CM導(dǎo)致成纖維細(xì)胞激活。3、AR通過激活MI后心臟EGFR信號(hào)通路導(dǎo)致CF的發(fā)生及心功能的降低。1)體外AR處理成纖維細(xì)胞后可激活成纖維細(xì)胞和EGFR信號(hào)通路,而EGFR抑制劑可明顯改善成纖維細(xì)胞和下游通路的激活水平;2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分Sham組,MI組、MI-shNC及MI-shAR組,其中慢病毒是在建MI模型時(shí)注射進(jìn)入梗死心肌周邊。(1)GFP熒光表明慢病毒注射成功,同時(shí)WB及RT-PCR技術(shù)表明慢病毒可下調(diào)第7天邊緣區(qū)AR的表達(dá);(2)28天內(nèi)MI-shAR組小鼠生存率較MI組高;(3)小動(dòng)物超聲結(jié)果表明MI-shAR組小鼠心功能明顯好轉(zhuǎn),而心衰指標(biāo)明顯降低;(4)取28天各組小鼠心臟后,應(yīng)用RT-PCR、WB、天狼猩紅染色、馬松三色染色以及IF技術(shù)表明MI-shAR組小鼠的梗死邊緣區(qū)纖維化面積及ECMs分泌明顯減少;(5)取7天各組小鼠的心臟,應(yīng)用TUNEL染色表明三組MI小鼠心肌細(xì)胞凋亡無明顯差異,同時(shí)WB技術(shù)表明AR誘導(dǎo)CF通過EGFR信號(hào)通路。結(jié)論本研究表明,MI后心臟巨噬細(xì)胞分泌大量AR,其后AR刺激巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1促進(jìn)CF,另一方面激活成纖維細(xì)胞EGFR信號(hào)通路參與CF。本研究揭示了AR與MI后CF之間的關(guān)系并探討具體機(jī)制,為MI后抗CF治療提供新靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

圖 2 TGF-β1 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌 AR(a) WB 檢測結(jié)果表明，TGF-β1 刺激后，BMDMs 明顯高表達(dá) AR，12h 達(dá)到高峰，且與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而成纖維細(xì)胞表達(dá)則無明顯改變。（b）RT-PCR 結(jié)果與 WB 結(jié)果顯示，即 BMDMs在TGF-β1 的刺激下高表達(dá)AR，而成纖維細(xì)胞則無明顯改變。（c）收集 TGF-β1刺激兩種細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞上清，Elisa 檢測 AR 的分泌水平，結(jié)果與 WB 結(jié)果相一致，即在 TGF-β1 的刺激下，BMDMs 可以分泌 AR 因子，而心臟成纖維細(xì)胞的分泌水平?jīng)]有顯著變化。** P <0.01；*** P <0.001。Fig.2 AR was secreted from macrophages after stimulated by TGF-β13.3 TGF-β1 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌雙調(diào)蛋白部分通過激活 MAPK 信號(hào)通路為了觀察 TGF-β1 是否通過激活 MAPK 信號(hào)通路誘導(dǎo) AR 分泌，用 TGF-β1

31圖 3 TGF-β1 部分通過 MAPK 信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌 AR（a） TGF-β1 刺激 BMDMs 15，30，60min 后，提取蛋白檢測 MAPK 通路的蛋白表達(dá)水平。WB 的結(jié)果表明 p38 和 JNK 磷酸化水平均在 15min 開始上升，30min 達(dá)高峰且與對照組對比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨后表達(dá)開始下調(diào)。（b-c） TGF-β1 刺激 BMDMs 后 AR 因子的分泌及 mRNA 表達(dá)水平可明顯的被 p38（SB）和 JNK（SP）的抑制劑下調(diào)。** P <0.01；***P <0.001。 SP = SP600125，SB = SB202190。

圖 1 AR 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向 M2 極化BMDMs 細(xì)胞用不同濃度的 AR 重組蛋白因子刺激 24h，收集細(xì)胞，RT-PCR 檢測細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平。（a-d）AR 能減低 BMDMs 的炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β1、iNOS）表達(dá)水平，且在濃度為 100pg/ml 時(shí)，降低水平最明顯，且與對照組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（e, f）AR能提高 BMDMs 的抗炎因子(Arg-1、IL-10）表達(dá)水平，且在濃度 100pg/ml 時(shí)，增加水平最明顯，且與對照組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig. 1 BMDMs transformed to M2 polarization after AR stimulation3.2 雙調(diào)蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌 TGF-β1研究表明，AR 可以導(dǎo)致多個(gè)臟器發(fā)生纖維化，然而 AR 對于 MI 后 CF 的發(fā)生是否有關(guān)仍未知。MI 后第 7 天心臟巨噬細(xì)胞是修復(fù)型巨噬細(xì)胞，可分泌大量的促纖維化因子 TGF-β1。此外，第一部分的結(jié)果已經(jīng)表明 AR 刺激巨噬細(xì)胞后
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本文編號(hào)：2875017