【目的】探究蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)在血小板凋亡中所發(fā)揮的作用。【方法】采集健康志愿者空腹靜脈全血,分離得到洗滌血小板及富含血小板血漿(Platelet rich plasma,PRP),調(diào)整血小板的濃度至3×108/ml。人的洗滌血小板與不同濃度的PKA抑制劑H89或?qū)φ斩谆鶃嗧?Dimethyl sulfoxide,DMSO)于22℃孵育160min,利用Western blot檢測(cè)血小板PKA底物GPIbβ(Ser166)的磷酸化程度,用電子顯微鏡觀察血小板的形態(tài)改變。人的洗滌血小板與H89(37.5μM)或?qū)φ誅MSO于22℃孵育不同的時(shí)間,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板線粒體跨膜電位(Mitochondrial inner transmembrane potential,ΔΨm)變化和磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)外翻程度。洗滌血小板與不同濃度的PKA激活劑Forskolin或陰性對(duì)照(DMSO)在室溫下孵育10min,然后用ABT737(1μM)在37℃條件下處理90min,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板ΔΨm和PS外翻的變化。采集6-8周三種PKA(PKA~(+/+)、PKA~(+/-)、PKA~(-/-))基因型小鼠下腔靜脈全血,分別檢測(cè)血小板的數(shù)量,PKA蛋白的表達(dá)情況和PKA底物GPIbβ的磷酸化程度,并且檢測(cè)血小板ΔΨm去極化程度。給野生型ICR小鼠注射PKA的抑制劑Rp-c AMPS,之后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)小鼠體內(nèi)血小板數(shù)量。從糖尿病患者和正常人全血中分別分離血小板和富含血小板血漿(Platelet rich plasma,PRP),使用Western blot檢測(cè)血小板中PKA底物GPIbβ的磷酸化程度,用ELISA法檢測(cè)血小板中PKA的活性,并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板ΔΨm和PS外翻的變化。利用ELISA法檢測(cè)糖尿病患者和正常人血漿中凝血酶產(chǎn)生的情況。在體外分別用Forskolin和不同濃度的凝血酶處理血小板,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板ΔΨm和PS外翻的變化。【結(jié)果】H89能夠?qū)е卵“逯蠵KA底物GPIbβ去磷酸化,ΔΨm去極化,PS外翻,質(zhì)膜皺縮。Forskolin能夠抑制由ABT737誘導(dǎo)的血小板ΔΨm去極化,PS外翻。與PKA~(+/+)小鼠相比,PKA~(-/-)小鼠體內(nèi)血小板數(shù)量明顯減少,PKA蛋白表達(dá)量明顯減少,PKA底物GPIbβ的磷酸化程度降低,血小板ΔΨm去極化。此外,PKA的抑制劑Rp-c AMPS能夠?qū)е乱吧虸CR小鼠體內(nèi)血小板數(shù)量減少。與正常對(duì)照組相比,糖尿病患者組血小板的PKA底物GPIbβ的磷酸化程度降低,ΔΨm去極化和PS外翻。糖尿病患者組血漿中凝血酶的含量明顯高于正常對(duì)照組。體外實(shí)驗(yàn)中,凝血酶能夠誘導(dǎo)血小板凋亡,并且Forskolin能夠抑制由凝血酶誘導(dǎo)的血小板凋亡�！窘Y(jié)論】這些數(shù)據(jù)表明:PKA能夠調(diào)控線粒體介導(dǎo)的血小板凋亡,PKA與某些疾病中血小板數(shù)量的減少相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為血小板減少癥患者的診斷和治療提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R55
【部分圖文】：

圖 1. H89 劑量依賴性誘導(dǎo)血小板 GPIbβ 蛋白去磷酸化利用 Western blot 檢測(cè)血小板中 GPIbβ、p-GPIbβ 的表達(dá)情況。ern blot 上樣量一致的標(biāo)準(zhǔn)。H89 時(shí)間依賴性誘導(dǎo)血小板 ΔΨm 去極化

圖 1. H89 劑量依賴性誘導(dǎo)血小板 GPIbβ 蛋白去磷酸化利用 Western blot 檢測(cè)血小板中 GPIbβ、p-GPIbβ 的表達(dá)情況。ern blot 上樣量一致的標(biāo)準(zhǔn)。H89 時(shí)間依賴性誘導(dǎo)血小板 ΔΨm 去極化

圖 2. H89 時(shí)間依賴性誘導(dǎo)血小板 ΔΨm 去極化.利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板 ΔΨm 變化。（Mean ±SD）。＊＊P＜0.01 DMSO 組相比。H89 時(shí)間依賴性誘導(dǎo)血小板 PS 外翻
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本文編號(hào)：2870764