研究背景心肌梗塞(myocardial infarction,MI)仍然是世界上發(fā)病率和死亡率最高心血管疾病。心梗后缺氧缺血以及氧化應(yīng)激產(chǎn)物蓄積導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,而凋亡細(xì)胞釋放的有毒物質(zhì)使細(xì)胞凋亡進(jìn)一步加劇。此外,這些直接的損傷也會(huì)引起左心室(left ventricular,LV)重構(gòu),最終導(dǎo)致心功能衰竭。因此,減少心肌細(xì)胞凋亡以及良好的梗塞微環(huán)境對(duì)于避免心室重構(gòu)和維持心臟功能至關(guān)重要。Fstl1(follistatin-like 1,Fstl1)可以減少心肌梗塞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。雖然心肌Fstl1在梗塞后微環(huán)境中明顯升高,但考慮到心梗后心肌重構(gòu)的嚴(yán)重程度,Fstl1的心臟保護(hù)效應(yīng)仍被局限在有限的范圍內(nèi)。所以我們假設(shè)在缺血心肌中可能存在Fstl1的抑制因子,它的沉默可能有助于心梗后恢復(fù)。微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)是一種廣泛表達(dá)的nc RNA,其長(zhǎng)度為17~24個(gè)核苷酸,它們通過(guò)抑制基因的翻譯和/或促使其m RNA的降解起到基因消音器的作用。我們推測(cè)心臟中可能存在內(nèi)源性的抑制Fstl1的miRNAs,它們的相互作用可以調(diào)節(jié)心梗后心肌重塑進(jìn)程,改善心梗預(yù)后。研究方法和結(jié)果通過(guò)利用Target Scan、micro RNA、miRDB這三個(gè)主要的在線軟件對(duì)Fstl1的調(diào)控基因進(jìn)行預(yù)測(cè),我們發(fā)現(xiàn)miR-9(micro RNA-9,miR-9)被預(yù)測(cè)為靶向Fstl1的潛在miRNA之一。miR-9在心梗組織中表達(dá)下降,且與Fstl1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。熒光素酶活性檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)miR-9靶向調(diào)控Fstl1。H9c2細(xì)胞中miR-9呈高表達(dá)的同時(shí)Fstl1表達(dá)下降,反之亦然。這表明miR-9靶向調(diào)控Fstl1且呈負(fù)相關(guān)性。為了進(jìn)一步分析miR-9在缺氧細(xì)胞中的作用機(jī)制,接下來(lái)我們建立缺氧細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染miR-9 mimics/inhibitor后進(jìn)行DAPI染色、LD-L微板法、DCF熒光染色及熒光素酶法檢測(cè),檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放量、ROS(reactive oxygen species,ROS)堆積水平及ATP(adenosine triphosphate,ATP)產(chǎn)生量。我們發(fā)現(xiàn)在缺氧細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染miR-9 mimics可加劇細(xì)胞凋亡、LDH釋放以及ROS堆積,減少ATP產(chǎn)量。這提示miR-9可以加劇細(xì)胞缺氧損傷。而轉(zhuǎn)染miR-9 inhibitor后結(jié)果恰恰相反,這從另一面支持上述觀點(diǎn)。隨后我們通過(guò)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立小鼠心梗模型。于心梗區(qū)周邊注射miR-9antagomir,7天后分別行心臟彩超、q PCR、TUNEL檢測(cè)、DHE染色、Masson’s thichrome染色、免疫熒光染色,檢測(cè)各項(xiàng)心功能指數(shù)、細(xì)胞凋亡率、ROS以及心肌纖維化程度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果提示在小鼠心梗模型中,通過(guò)antagomir沉默體內(nèi)miR-9的表達(dá)可以有效的保護(hù)心梗后心臟功能,減輕纖維化變性及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。進(jìn)一步的研究表明,antagomir不僅可以穩(wěn)定Fstl1的表達(dá),而且能夠阻止心肌細(xì)胞凋亡和ROS的蓄積。同法注射miR-9 agomir,結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌纖維化面積、細(xì)胞凋亡率顯著升高。以上數(shù)據(jù)均表明miR-9參與調(diào)控心梗后心肌重塑。最后,為了驗(yàn)證miR-9是否通過(guò)Fstl1對(duì)細(xì)胞缺氧損傷進(jìn)行調(diào)控,我們轉(zhuǎn)染miR-9inhibitor+si Fstl1/si NC至缺氧H9c2細(xì)胞。結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率和ROS水平明顯上升,說(shuō)明同時(shí)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-9和Fstl1的表達(dá)則能夠部分逆轉(zhuǎn)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-9對(duì)細(xì)胞缺氧損傷的抑制作用�？傊�,抑制miR-9通過(guò)靶向Fstl1對(duì)抗缺氧損傷。研究結(jié)論綜上所述,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了miR-9通過(guò)靶向Fstl1 3’-UTR調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性,并與Fstl1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。miR-9參與調(diào)控心肌細(xì)胞缺氧損傷。抑制miR-9減輕心梗后心肌重塑。miR-9調(diào)控細(xì)胞缺氧損傷是通過(guò)調(diào)控Fstl1來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這為心肌梗塞的早期治療提供了一種新的潛在策略。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

圖5w月nansuuuuwuuuuuuuunccnna}c寧17V兩叼WiA1JACUV1iUUAt口林映婦G獷「?jìng)?cè)d1S口月浪

圖 2 心肌梗塞后 Fstl1 和 miR-9 的基因表達(dá)（A）Fstl1；（B）miR-9；n= 4 -8. ***, P< 0.001素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)顯示 miR-9 靶向調(diào)控 Fstl1主要通過(guò)與靶基因 mRNA 3'-UTR 完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)而

Mi croRNA-9 調(diào)控小鼠心肌梗塞后心肌重塑的相關(guān)機(jī)制研究 第一部分酶催化產(chǎn)生的熒光數(shù)值，從而以海腎熒光素酶活性變動(dòng)狀態(tài)為依據(jù)對(duì)靶基因受微小核糖核酸的調(diào)控功能進(jìn)行觀察。我們通過(guò)體外培養(yǎng) 293T 細(xì)胞，然后進(jìn)行卵泡抑素樣蛋白 1（用于轉(zhuǎn)染）的熒光酶報(bào)告基因（3'-UTR 活性檢測(cè)）載體構(gòu)建，也就是 pmirGLO-Fstl1 3'-UTR 野生型（wildtype，WT）和突變型（mutant， MUT），利用向 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染報(bào)告基因載體與miR-9mimics，檢測(cè)螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因。檢測(cè)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染 mimics NC 的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 miR-9 mimics 后，攜帶有 Fstl1 野生型報(bào)告基因載體組的熒光素酶信號(hào)強(qiáng)度顯著降低（P < 0.001）；而攜帶有 Fstl1 突變型報(bào)告基因載體組，miR-9 mimics轉(zhuǎn)染通常不會(huì)明顯干擾到螢火蟲螢光素酶信號(hào)強(qiáng)度（P > 0.05）（圖 3）。以上結(jié)果都證明，miR-9 靶向調(diào)控 Fstl1。
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本文編號(hào)：2869183