研究背景心肌梗塞(myocardial infarction,MI)仍然是世界上發(fā)病率和死亡率最高心血管疾病。心梗后缺氧缺血以及氧化應激產(chǎn)物蓄積導致心肌細胞凋亡,而凋亡細胞釋放的有毒物質使細胞凋亡進一步加劇。此外,這些直接的損傷也會引起左心室(left ventricular,LV)重構,最終導致心功能衰竭。因此,減少心肌細胞凋亡以及良好的梗塞微環(huán)境對于避免心室重構和維持心臟功能至關重要。Fstl1(follistatin-like 1,Fstl1)可以減少心肌梗塞誘導的心肌細胞凋亡。雖然心肌Fstl1在梗塞后微環(huán)境中明顯升高,但考慮到心梗后心肌重構的嚴重程度,Fstl1的心臟保護效應仍被局限在有限的范圍內(nèi)。所以我們假設在缺血心肌中可能存在Fstl1的抑制因子,它的沉默可能有助于心梗后恢復。微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)是一種廣泛表達的nc RNA,其長度為17~24個核苷酸,它們通過抑制基因的翻譯和/或促使其m RNA的降解起到基因消音器的作用。我們推測心臟中可能存在內(nèi)源性的抑制Fstl1的miRNAs,它們的相互作用可以調(diào)節(jié)心梗后心肌重塑進程,改善心梗預后。研究方法和結果通過利用Target Scan、micro RNA、miRDB這三個主要的在線軟件對Fstl1的調(diào)控基因進行預測,我們發(fā)現(xiàn)miR-9(micro RNA-9,miR-9)被預測為靶向Fstl1的潛在miRNA之一。miR-9在心梗組織中表達下降,且與Fstl1表達呈負相關性。熒光素酶活性檢測進一步證實miR-9靶向調(diào)控Fstl1。H9c2細胞中miR-9呈高表達的同時Fstl1表達下降,反之亦然。這表明miR-9靶向調(diào)控Fstl1且呈負相關性。為了進一步分析miR-9在缺氧細胞中的作用機制,接下來我們建立缺氧細胞模型。轉染miR-9 mimics/inhibitor后進行DAPI染色、LD-L微板法、DCF熒光染色及熒光素酶法檢測,檢測細胞凋亡率、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放量、ROS(reactive oxygen species,ROS)堆積水平及ATP(adenosine triphosphate,ATP)產(chǎn)生量。我們發(fā)現(xiàn)在缺氧細胞中,轉染miR-9 mimics可加劇細胞凋亡、LDH釋放以及ROS堆積,減少ATP產(chǎn)量。這提示miR-9可以加劇細胞缺氧損傷。而轉染miR-9 inhibitor后結果恰恰相反,這從另一面支持上述觀點。隨后我們通過冠狀動脈結扎法建立小鼠心梗模型。于心梗區(qū)周邊注射miR-9antagomir,7天后分別行心臟彩超、q PCR、TUNEL檢測、DHE染色、Masson’s thichrome染色、免疫熒光染色,檢測各項心功能指數(shù)、細胞凋亡率、ROS以及心肌纖維化程度和炎性細胞浸潤情況。結果提示在小鼠心梗模型中,通過antagomir沉默體內(nèi)miR-9的表達可以有效的保護心梗后心臟功能,減輕纖維化變性及巨噬細胞浸潤。進一步的研究表明,antagomir不僅可以穩(wěn)定Fstl1的表達,而且能夠阻止心肌細胞凋亡和ROS的蓄積。同法注射miR-9 agomir,結果發(fā)現(xiàn)心肌纖維化面積、細胞凋亡率顯著升高。以上數(shù)據(jù)均表明miR-9參與調(diào)控心梗后心肌重塑。最后,為了驗證miR-9是否通過Fstl1對細胞缺氧損傷進行調(diào)控,我們轉染miR-9inhibitor+si Fstl1/si NC至缺氧H9c2細胞。結果顯示細胞凋亡率和ROS水平明顯上升,說明同時下調(diào)細胞內(nèi)miR-9和Fstl1的表達則能夠部分逆轉下調(diào)細胞內(nèi)miR-9對細胞缺氧損傷的抑制作用�？傊�,抑制miR-9通過靶向Fstl1對抗缺氧損傷。研究結論綜上所述,我們的實驗結果證實了miR-9通過靶向Fstl1 3’-UTR調(diào)控其轉錄活性,并與Fstl1表達呈負相關。miR-9參與調(diào)控心肌細胞缺氧損傷。抑制miR-9減輕心梗后心肌重塑。miR-9調(diào)控細胞缺氧損傷是通過調(diào)控Fstl1來實現(xiàn)的。這為心肌梗塞的早期治療提供了一種新的潛在策略。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

圖5w月nansuuuuwuuuuuuuunccnna}c寧17V兩叼WiA1JACUV1iUUAt口林映婦G獷「側d1S口月浪

圖 2 心肌梗塞后 Fstl1 和 miR-9 的基因表達（A）Fstl1；（B）miR-9；n= 4 -8. ***, P< 0.001素報告酶實驗顯示 miR-9 靶向調(diào)控 Fstl1主要通過與靶基因 mRNA 3'-UTR 完全或不完全互補配對而

Mi croRNA-9 調(diào)控小鼠心肌梗塞后心肌重塑的相關機制研究 第一部分酶催化產(chǎn)生的熒光數(shù)值，從而以海腎熒光素酶活性變動狀態(tài)為依據(jù)對靶基因受微小核糖核酸的調(diào)控功能進行觀察。我們通過體外培養(yǎng) 293T 細胞，然后進行卵泡抑素樣蛋白 1（用于轉染）的熒光酶報告基因（3'-UTR 活性檢測）載體構建，也就是 pmirGLO-Fstl1 3'-UTR 野生型（wildtype，WT）和突變型（mutant， MUT），利用向 293T 細胞轉染報告基因載體與miR-9mimics，檢測螢火蟲螢光素酶報告基因。檢測結果表明，與轉染 mimics NC 的對照組相比，轉染 miR-9 mimics 后，攜帶有 Fstl1 野生型報告基因載體組的熒光素酶信號強度顯著降低（P < 0.001）；而攜帶有 Fstl1 突變型報告基因載體組，miR-9 mimics轉染通常不會明顯干擾到螢火蟲螢光素酶信號強度（P > 0.05）（圖 3）。以上結果都證明，miR-9 靶向調(diào)控 Fstl1。
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本文編號：2869183