目的:血清磷酸鹽的正常水平為3.0-4.5mg/dL,其作為人體重要營養(yǎng)物質之一,參與到人體內多種調節(jié)和代謝過程。高磷血癥,即血清中無機磷酸鹽的水平增高,與心血管疾病發(fā)病率和死亡率的增加相關。有研究顯示升高的磷酸鹽會加重慢性腎臟病患者心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。即使對于健康人群來說,飲食中攝入含磷量過高的食物也會增加心血管疾病的發(fā)生率和死亡率。高磷酸鹽會誘發(fā)血管平滑肌細胞向成骨樣細胞轉變,最終發(fā)展成血管鈣化。雖然已有研究表示高磷酸鹽會導致內皮細胞的凋亡,但對其中的機制的研究尚不多。某些數(shù)據(jù)顯示microRNA會調控細胞的生長和凋亡情況,由microRNA的表達改變而引起的異常調節(jié)被認為是引起心血管不利結局的主要機制之一。本次研究主要針對高磷酸鹽如何誘導內皮細胞凋亡進行研究,探討microRNA在此過程中起到的作用,以及其他潛在機制。研究方法:1.實驗分組本實驗應用小鼠心肌內皮細胞進行研究。應用無磷酸鹽(0mmol/L)以及含有0.1mmol/L、1.0mmol/L、5.0mmol/L濃度磷酸鹽的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,進行細胞生長以及基因微列陣實驗。在探討凋亡情況以及蛋白等表達變化實驗中,主要應用兩組含磷量不同的培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng):對照組:含有磷酸鹽濃度為1.0mM的正常培養(yǎng)液;實驗組:含有磷酸鹽濃度為5.0mM的高磷酸鹽培養(yǎng)液。培養(yǎng)72小時后,檢測細胞的凋亡情況、相關蛋白表達情況、RNA和microRNA的表達水平。針對microRNA-21如何參與此過程的研究中,需進行細胞轉染后用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)。共分為六組,即分別以對照組、實驗組、miR-21模仿劑組、模仿劑對照組、miR-21抑制劑組、抑制劑對照組培養(yǎng)細胞后,檢測細胞凋亡以及蛋白表達情況。在ERK1/2調節(jié)研究中,分別應用對照組、實驗組、ERK1/2抑制劑組、抑制劑陰性對照組進行細胞培養(yǎng)72小時后,檢測相關蛋白變化。2.xCELLigence分析細胞生長情況應用xCELLigence實時細胞電子分析技術進行細胞生長曲線測定。以含有不同磷酸鹽濃度(0mM、0.1mM、1.0mM和5.0mM)的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。應用分析儀每一個小時監(jiān)測一次細胞生長情況,實驗結束后生成細胞生長曲線。3.免疫熒光染色實驗測定細胞凋亡情況將細胞用正常和高磷酸鹽培養(yǎng)液培養(yǎng)72個小時之后,應用細胞死亡檢測試劑盒進行染色后在免疫熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。4.流式細胞術檢測細胞凋亡情況以相應的條件培養(yǎng)細胞后,根據(jù)所應用的凋亡檢測試劑盒說明書進行細胞標記染色。分別加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素標記液以及碘化丙啶標記液。孵育5分鐘后用流式細胞儀進行細胞凋亡的分析。5.基因微列陣檢測實驗檢測microRNA的表達應用不同磷酸鹽含量(0mM,0.1mM,1.0mM和5.0mM)的培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時,提取全部RNA后提交給美國北卡羅萊納大學微列陣實驗室部門進行雜化以及微列陣差異性顯著分析。6.細胞轉染實驗檢測凋亡以及PDCD4、NF-κB表達情況依照設計的分組應用RNAiMAX轉染試劑盒進行microRNA21模仿劑和抑制劑轉染實驗后,應用不同濃度磷酸鹽培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時。用流式細胞術檢測細胞凋亡情況,western blot方法檢測PDCD4、NF-κB的表達水平。7.細胞高磷短暫激活實驗檢測ERK1/2的表達將內皮細胞用高磷酸鹽培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng),分別培養(yǎng)的時間為0分鐘,1分鐘,5分鐘,10分鐘,30分鐘和60分鐘。行western blot實驗檢測ERK1/2和p-ERK1/2的表達變化。8.Western Blot檢測PDCD4、PTEN、PARP、NF-κB的表達以相應條件培養(yǎng)細胞后,行western blot實驗。加樣后,電泳30分鐘,轉膜1個小時,應用5%脫脂奶粉封閉一個小時。使用的一抗為兔抗cleaved caspase-3、兔抗PDCD4、兔抗PTEN、兔抗PARP、兔抗ERK1/2、兔抗p-ERK1/2、兔抗NF-κB(RelA p65)、兔抗NF-κB1、兔抗NF-κB2以及鼠抗β-actin,4℃過夜。孵育二抗完畢后,應用ECL曝光試劑進行曝光。用ImageJ軟件分析條帶密度值。9.RT-PCR實驗檢測microRNA的表達以及相關蛋白在RNA表達水平MicroRNA的RT-PCR實驗是應用miRNeasy試劑盒提取RNA,miScript II RT試劑盒進行逆轉錄后應用miScript SYBR Green PCR試劑盒進行RT-PCR樣品配制。PDCD4、PTEN、PARP、NF-κB的RT-PCR實驗,首先應用RNeasy試劑盒提取RNA,iScript試劑盒進行逆轉錄后,應用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix試劑盒進行RT-PCR樣品配制。最后應用QuantStudio 6 Flex PCR儀器分別使用相應的RT-PCR步驟進行實驗。完成后,用2~(-ΔΔCT)法進行計算。10.ERK抑制劑實驗檢測PDCD4以及NF-κB表達變化依照分組情況分別培養(yǎng)細胞72小時后應用western blot檢測ERK1/2、p-ERK1/2、PDCD4以及NF-κB的表達。11.統(tǒng)計方法所有的數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標準差(mean±SD)來進行表達,以T檢驗(t test)來進行統(tǒng)計學分析。p0.05時有統(tǒng)計學意義。應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗結果:1.高磷酸鹽導致內皮細胞凋亡(1)xCelligence系統(tǒng)實時監(jiān)控細胞生長情況,結果顯示:內皮細胞在含有0mM濃度磷酸鹽的培養(yǎng)液中生長較為緩慢。在前48小時之內,0.1mM、1.0mM和5.0mM磷酸鹽含量的培養(yǎng)液條件下細胞生長情況是相近的。第三天后,5mM磷酸鹽含量培養(yǎng)液培養(yǎng)的內皮細胞數(shù)目出現(xiàn)了下降偏差。(2)免疫熒光染色實驗和流式細胞實驗顯示,相比正常培養(yǎng)液組,在高磷酸鹽培養(yǎng)液培養(yǎng)下的內皮細胞,凋亡數(shù)目有所增加(p0.05)。(3)Western blot檢測Cleaved Caspase-3蛋白表達,相對于正常培養(yǎng)液組,高磷培養(yǎng)液培養(yǎng)組的凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3有明顯的升高(p0.05)。2.高磷酸鹽使microRNA-21的表達增加(1)應用Affymetrix基因微列陣檢測實驗檢測547個microRNA的表達。與正常培養(yǎng)液培養(yǎng)組相比,在高磷酸鹽的條件下,9個microRNA有明顯的增加,65個microRNA的表達下降。在這74個microRNA當中,1.0mM和5.0mM同時與0mM和1.0mM對比,33個microRNA有明顯的變化。microRNA-21在磷酸鹽濃度為5.0mM時有明顯的增加,microRNA-145,-143,-143hg,-22,-5123以及-1938在5.0mM的濃度中有所下降,microRNA-125和其他24個microRNA在0mM和5.0mM兩種磷酸鹽濃度中均有提升或者下降。(2)RT-PCR檢測所選取的部分重點microRNA,與正常培養(yǎng)液組相比,microRNA-21、-125在高磷酸鹽下表達有所增加(p0.05);microRNA-142、-143有所下降(p0.05)。3.MicroRNA21直接調節(jié)由高磷酸鹽誘導的內皮細胞凋亡應用microRNA-21模仿劑和抑制劑轉染后進行不同磷酸鹽濃度的培養(yǎng)。與正常培養(yǎng)液組相比,加入模仿劑的正常培養(yǎng)液組和高磷酸鹽培養(yǎng)液組凋亡數(shù)目有所增加(p0.05);與高磷酸鹽培養(yǎng)液組相比,加入抑制劑的高磷酸鹽培養(yǎng)液組凋亡數(shù)目有所減少(p0.05)。4.MicroRNA-21調節(jié)由高磷酸鹽引起的PDCD4降低(1)Western blot檢測microRNA-21的目標蛋白PDCD4、PTEN和PARP,相對于正常培養(yǎng)液組,在高磷酸鹽培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下表達都有所減少(p0.05)。(2)應用RT-PCR檢測以上目標蛋白在RNA水平表達,與正常磷酸鹽組相比,高磷酸鹽組的表達有所下降(p0.05)。(3)應用microRNA-21模仿劑和抑制劑實驗檢測PDCD4的表達。與正常磷酸鹽組相比,PDCD4在高磷酸鹽組和模仿劑加正常磷酸鹽組中都有所下降(p0.05);與高磷酸鹽組相比,抑制劑加高磷酸鹽組中的PDCD4有所上升(p0.05)。5.高磷酸鹽激活ERK1/2通路調節(jié)PDCD4的表達(1)在高磷酸鹽的短時間刺激下,ERK1/2發(fā)生磷酸化,即p-ERK1/2的表達在短時間內就有所增加。(2)長時間(72小時)高磷酸鹽培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,與正常培養(yǎng)組相比,高磷酸鹽組的p-ERK1/2表達有所增加(p0.05)。(3)應用ERK1/2抑制劑檢測PDCD4表達的變化。與正常培養(yǎng)液組相比,高磷酸鹽組的PDCD4表達下降(p0.05);應用ERK1/2抑制劑組的p-ERK1/2表達明顯下降(p0.05),而此時該組的PDCD4表達有所增加(p0.05)。6.ERK1/2調控由高磷酸鹽引起的NF-κB的降低(1)在不同磷酸鹽含量(1.0mM和5.0mM)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞72小時之后,用western blot檢測NF-κB各亞群(RelA,NF-κB1和NF-κB2)的表達。與正常培養(yǎng)液組相比,RelA(p65)和NF-κB1的表達在高磷酸鹽條件下明顯下降(p0.05),NF-κB2沒有變化。(2)應用ERK1/2抑制劑實驗檢測NF-κB(RelA)的變化。與正常組相比,高磷酸鹽組RelA的表達有所下降(p0.05);與高磷酸鹽組相比,ERK1/2抑制劑組的RelA表達有所增加(p0.05)。(3)應用microRNA-21模仿劑和抑制劑轉轉染,用不同條件培養(yǎng)內皮細胞后行western blot,NF-κB(RelA)的表達并沒有變化。結論:1.高磷酸鹽會在體外誘導內皮細胞的凋亡增加。2.MicroRNA-21可以調節(jié)由高磷酸鹽引起的細胞凋亡,并使相關目標蛋白PDCD4的表達有所減少。3.此過程同時激活了ERK1/2/PDCD4傳導通路。4.高磷酸鹽下調了NF-κB的表達,此過程依賴ERK1/2傳導通路而非microRNA-21通路。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R54
【部分圖文】：

17圖 2. 免疫熒光技術觀察內皮細胞凋亡情況A.TUNEL 染色，磷酸鹽含量 1.0mM；B.TUNEL 染色，磷酸鹽含量 5.0mM；C.DAPI，磷酸鹽含量 1.0mM；D.DAPI，磷酸鹽含量 5.0mM如圖 3 所示，應用流式方法再次驗證在不同磷酸鹽濃度培養(yǎng)液下內皮細胞的凋亡情況。結果顯示：相比于正常培養(yǎng)液，在 5.0mM 磷酸鹽含量培養(yǎng)液培養(yǎng)下的內皮細胞，凋亡數(shù)目有所增加（p<0.05）。

中國醫(yī)科大學博士學位論文而磷酸鹽濃度降低時它的表達也隨之下降了。 該結果可以說明在內皮細胞中，microRNA-21 的表達或許是由磷酸鹽所調節(jié)的。同樣的，microRNA-145，-143，-143hg，-22，-5123 以及-1938 都是在 5.0mM 的濃度中有所下降，而在磷酸鹽濃度下降后反而有所提升。另一方面，結果顯示 microRNA-125 和其他 24 個 microRNA 在 0mM和 5.0mM 兩種磷酸鹽濃度中均有提升或者下降。

中國醫(yī)科大學博士學位論文而磷酸鹽濃度降低時它的表達也隨之下降了。 該結果可以說明在內皮細胞中，microRNA-21 的表達或許是由磷酸鹽所調節(jié)的。同樣的，microRNA-145，-143，-143hg，-22，-5123 以及-1938 都是在 5.0mM 的濃度中有所下降，而在磷酸鹽濃度下降后反而有所提升。另一方面，結果顯示 microRNA-125 和其他 24 個 microRNA 在 0mM和 5.0mM 兩種磷酸鹽濃度中均有提升或者下降。
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本文編號：2866742