研究背景冠心病(CAD)是一種嚴重威脅人類健康的疾病之一,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢,而早期診斷和治療冠心病能有效降低其死亡率;但目前尚無理想的診斷冠心病的生物標志物,因此發(fā)展一種新的、有更高的敏感性和特異性的生物標志物具有重要意義。Micro RNA(mi RNA)是一類長度為19~24個核糖核苷酸的非編碼內(nèi)源性小單鏈RNA分子,且在心血管系統(tǒng)高度表達,幾乎參與調(diào)控了心臟所有的病理生理過程,在心臟的正常發(fā)育、冠狀動脈粥樣硬化、心肌細胞損傷等過程中均發(fā)揮著重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)血漿中mi RNA能穩(wěn)定存在,且隨疾病發(fā)生發(fā)展而表達水平發(fā)生改變;因此,血漿mi RNA檢測可能成為冠心病診斷和治療的理想生物標志物;而目前這方面的研究尚很少。目的:本研究的目的是篩選出冠心病患者血漿中與正常人血漿相比存在顯著差異的mi RNAs;同時進一步研究上游轉(zhuǎn)錄因子對mi RNA(s)的調(diào)控作用,為mi RNA(s)在冠心病發(fā)病機制中的調(diào)控作用提供實驗基礎(chǔ)。方法:選擇2012年9月至2013年10月在寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院心血管內(nèi)科就診患者,冠心病組為通過冠狀動脈造影診斷至少有一條或一條以上的主干冠狀動脈狹窄大于50%或以上的患者;正常對照組為通過冠狀動脈造影診斷冠狀動脈未見狹窄或僅有心肌橋病變的患者。運用mi RNA基因芯片技術(shù)初步篩選冠心病病人和正常健康者血漿中的mi RNA表達譜,每組各3例樣本,然后通過對基因芯片結(jié)果進行聚類分析,并對冠心病組中表達顯著升高且差異倍數(shù)5倍的mi RNAs進一步采用q RT-PCR技術(shù)進行擴大樣本量(冠心病組:120例,正常對照組120例)驗證,以尋找在冠心病中有顯著差異表達的mi RNAs。同時,通過生物信息學軟件預測與冠心病相關(guān)mi RNA(s)基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;然后進一步應(yīng)用雙螢光素酶實驗進行驗證其可靠性。結(jié)果:mi RNA基因芯片初篩結(jié)果顯示,與正常組相比,有4個mi RNAs(mi R-206、mi R-302a-3p、mi R-383、mi R-574-5p)在冠心病組中表達顯著升高(P值均0.01)且表達倍數(shù)均大于5倍。進一步運用q RT-PCR技術(shù)擴大樣本量進行驗證結(jié)果顯示,mi R-206和mi R-574-5p在冠心病組中的表達水平與正常組相比仍存在顯著差異(P值均0.01);且ROC曲線表明這兩個mi RNAs對冠心病的診斷均有較好的敏感性和特異性。同時,生物信息學軟件預測hsa-mi R-206啟動子區(qū)有2個轉(zhuǎn)錄因子Myo D結(jié)合位點;進一步雙螢光素酶報告基因測定系統(tǒng)證實Myo D能與hsa-mi R-206啟動子區(qū)直接進行靶向結(jié)合作用。結(jié)論:血漿mi R-206和mi R-574-5p在冠心病病人中表達顯著升高,可能成為診斷冠心病的循環(huán)生物標志物;同時轉(zhuǎn)錄因子Myo D能與hsa-mi R-206上游啟動子區(qū)直接結(jié)合,這為進一步研究轉(zhuǎn)錄因子Myo D與mi R-206的相互作用及mi R-206與冠心病相關(guān)的生物網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究奠定實驗基礎(chǔ)。
【學位單位】：寧波大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R541.4
【部分圖文】：

GenePix Pro 6.0軟件完成分析, 通過原始值減去背景值來做修正, 并用中值做標準化, 分別計算出3個冠心病患者及3個正常對照樣本中miRNA的標準值及兩兩之間標準值的比值. 用Volcano Plot 挑選出差異表達的miRNA(圖1), 用MEV軟件對差異表達miRNA進行聚類分析。結(jié)果顯示：通過miRNA基因芯片檢測并統(tǒng)計分析后結(jié)果顯示，表達差異倍數(shù)大于5倍的miRNA分子共33個(圖2)。本實驗進一步根據(jù)以下兩個標準： 冠心病組與正常對照組相比，miRNA表達升高有顯著差異（P<0.01）； 通過生物信息學預測相關(guān)miRNA的靶基因證實與冠心病的發(fā)生有關(guān)[15-17]，初步篩選出4個差 異 表 達 的 miRNAs（ miR-206、 miR-302a-3p、 miR-383、 miR-574-5p） （ 表2）。圖 1 火山口圖：冠心病患者與正常對照組之間 miRNA 表達差異Figure 1. Volcano plot of all pairwise comparisons. Comparisons of all miRNAsassessed in microarray analysis of RNA isolated from plasma of patients withCAD(n=3) or healthy volunteers(n=3). The volcano plot displays the relationshipbetween fold-change and significance between the two groups using a scatter plotview. The y-axis is the negative log10 of P values(a higher value indicates g

件對差異表達miRNA進行聚類分析。結(jié)果顯示：通過miRNA基因芯片檢測并統(tǒng)計分析后結(jié)果顯示，表達差異倍數(shù)大于5倍的miRNA分子共33個(圖2)。本實驗進一步根據(jù)以下兩個標準： 冠心病組與正常對照組相比，miRNA表達升高有顯著差異（P<0.01）； 通過生物信息學預測相關(guān)miRNA的靶基因證實與冠心病的發(fā)生有關(guān)[15-17]，初步篩選出4個差 異 表 達 的 miRNAs（ miR-206、 miR-302a-3p、 miR-383、 miR-574-5p） （ 表2）。圖 1 火山口圖：冠心病患者與正常對照組之間 miRNA 表達差異Figure 1. Volcano plot of all pairwise comparisons. Comparisons of all miRNAsassessed in microarray analysis of RNA isolated from plasma of patients withCAD(n=3) or healthy volunteers(n=3). The volcano plot displays the relationshipbetween fold-change and significance between the two groups using a scatter plotview. The y-axis is the negative log10 of P values(a higher value indicates greater

10.6 冠心病組與正常對照組中 miRNA 的相對表達水平選擇年齡、性別均匹配的冠心病患者（120 例）和正常對照組（120 例），提取血漿中的 RNA, 運用 miR-206、miR-302a-3p、miR-383、miR-574-5p 分子末端加 poly(A)尾法進行逆轉(zhuǎn)錄，再用 SYBRGreen 法進行 real-time PCR 檢測，RNU6 (核仁小 RNA)做為內(nèi)參。計算 2- CT后，通過兩組比較 t 檢驗分析病例和對照組中的 miR-206、miR-302a-3p、miR-383、miR-574-5p 的表達差異。結(jié)果顯示，病例組中 miR-206 和 miR-574-5p 的表達水平顯著高于正常對照組, 差異有統(tǒng)計學意義（P 值均<0.01)；而病例組中 miR-302a-3p 和 miR-383 的表達水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（p 值分別=0.359；p=0.918）。見圖 5A-D。
【共引文獻】

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本文編號：2836082