【研究背景和目的】原發(fā)性高血壓病是一種人類常見的慢性病,它是以血壓升高為主要特征,并伴有血管、心臟等重要臟器并發(fā)癥的一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,發(fā)病率長(zhǎng)期居高不下。有調(diào)查顯示,我國(guó)有23.3%的成年人約2.45億患有高血壓病,而根據(jù)2017年美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)新修訂的高血壓標(biāo)準(zhǔn)(收縮壓≥130mmHg,舒張壓≥80mmHg),我國(guó)高血壓的患病率高達(dá)46.4%,而我國(guó)高血壓的控制率為17%。因此,對(duì)高血壓發(fā)病機(jī)理的研究和尋找更高效的的治療策略,仍是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。高血壓病除外周心血管系統(tǒng)的一系列特征表現(xiàn)外,中樞神經(jīng)系統(tǒng)交感輸出亢進(jìn)是高血壓病發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制之一。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的眾多核團(tuán)中,頭端延髓腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是調(diào)控交感輸出和基礎(chǔ)血壓的關(guān)鍵中樞,RVLM神經(jīng)元功能異常與高血壓和交感興奮性增高密切相關(guān)。研究證實(shí)中樞腎素血管緊張系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)過(guò)度激活是高血壓病中樞交感輸出的重要機(jī)制之一,增多的血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)可以降低中樞壓力敏感反射,增強(qiáng)中樞交感縮血管緊張性,導(dǎo)致血壓的異常增高。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin converting enzyme 2,ACE2)是腎素血管緊張系統(tǒng)家族中的新成員,ACE2將血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ,AngⅠ)和AngⅡ轉(zhuǎn)化成血管緊張素-(1-7)[Angiotensin(1-7),Ang-(1-7)],并拮抗AngⅡ的升壓效果而發(fā)揮作用,而RAS和ACE2相關(guān)軸之間的平衡對(duì)維持正常血壓和自主神經(jīng)功能的中樞調(diào)節(jié)非常重要。已有研究證實(shí),原發(fā)性高血壓狀態(tài)下大鼠RVLM內(nèi)ACE2的表達(dá)顯著下降,而在該區(qū)域過(guò)表達(dá)ACE2可使血壓和腎交感活性顯著下降。因此,ACE2在中樞調(diào)控心血管功能中的作用十分顯著,也是當(dāng)前尋求新的高血壓防治策略的研究靶點(diǎn)之一,但目前高血壓中樞ACE2功能降低的機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞中ACE2是I型跨膜蛋白,由細(xì)胞外的N端結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)和一個(gè)短的胞內(nèi)C末端組成,細(xì)胞外液中可溶性ACE2的形式為缺乏其胞內(nèi)和跨膜結(jié)構(gòu)域的胞外部分。ACE2的作用功能目前研究較為廣泛,而上游對(duì)其調(diào)控的機(jī)理目前尚不清晰,研究較少。有研究顯示鑲嵌在細(xì)胞膜表面的解聚素和金屬蛋白酶17(A Disintegrin and Metalloproteases 17,ADAM17)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞ACE2活性,ADAM17可以剪切細(xì)胞表面的多種蛋白質(zhì),從而發(fā)揮其多樣的生理功能。它在機(jī)體內(nèi)很多個(gè)器官都有表達(dá),參與了一些生理和病理進(jìn)程。ADAM17在細(xì)胞膜表面可以通過(guò)蛋白水解作用,剪切細(xì)胞膜上的ACE2,使得ACE2胞外部分脫落,進(jìn)入細(xì)胞外液,降低細(xì)胞膜上ACE2的活性功能,導(dǎo)致細(xì)胞外液的可溶性ACE2片段增多。在一型糖尿病秋田(Akita)小鼠腎小管中,ADAM17表達(dá)增加,它通過(guò)剪切細(xì)胞膜上ACE2使得尿液中的游離ACE2片段(70KDa)增加,給予胰島素可逆轉(zhuǎn)這一狀況。有研究證實(shí)AngⅡ灌注下,心臟ADAM17活性增加,ACE2表達(dá)減少且活性下降,最終引起心臟肥大和纖維化。組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP3)是ADAM17的內(nèi)源性抑制劑,它可以抑制了ADAM17介導(dǎo)的底物胞外域脫落。有研究報(bào)道,AngⅡ誘導(dǎo)可以增加心肌TIMP3表達(dá)增加,而AngⅡ的灌流兩周不能使TIMP3~(-/-)小鼠的心臟肥大,可見TIMP3參與AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大的病理過(guò)程。研究證實(shí)中樞腦組織中存在ADAM17的表達(dá),其是否參與中樞特別是交感中樞RVLM內(nèi)ACE2的調(diào)節(jié),仍不清楚。有研究報(bào)道,白藜蘆醇(resveratrol,RSV)在外周可以增加TIMP3表達(dá),而果糖誘導(dǎo)的高血壓大鼠口服RSV的1周后血壓下降,那么RSV是否通過(guò)TIMP3/ADAM17作用,增加了中樞內(nèi)ACE2的功能從而參與血壓的調(diào)控呢,我們?nèi)圆磺宄�。RSV是一類多酚類化合物,具有多種的心血管調(diào)節(jié)保護(hù)功能。RSV在很多病理和生理?xiàng)l件下可以增加ACE2的表達(dá)和活性,改善疾病狀態(tài)。如RSV通過(guò)上調(diào)腹主動(dòng)脈和腎上主動(dòng)脈的ACE2的表達(dá)和活性來(lái)抑制ApoE~(-/-)小鼠腹主動(dòng)脈瘤的生長(zhǎng)。此外,攝入RSV可以增加高脂飲食小鼠脂肪組織中ACE2的表達(dá),而降低ACE的表達(dá)。此前,本課題組發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠中樞第四腦室灌流RSV產(chǎn)生抗高血壓效應(yīng),且高血壓大鼠RVLM內(nèi)ACE2的變化直接影響血壓和交感輸出,而ACE2的活性受到ADAM17的調(diào)控,同時(shí)ACE2和ADAM17也受到AngⅡ的調(diào)節(jié),那么RSV在中樞的抗高血壓效應(yīng)是否通過(guò)ADAM17蛋白介導(dǎo)調(diào)節(jié)RVLM內(nèi)的ACE2活性來(lái)參與的呢?中樞RVLM內(nèi)RAS系統(tǒng)異常是否通過(guò)ADAM17介導(dǎo)調(diào)節(jié)ACE2的活性并參與高血壓的形成呢?因此,根據(jù)以上背景確立本課題的研究目標(biāo)是(1)高血壓大鼠中樞ACE2活性下降是否與TIMP3/ADAM17的異常相關(guān),正常血壓大鼠WKY中樞灌流AngⅡ能否在RVLM內(nèi)通過(guò)TIMP3/ADAM17來(lái)降低ACE2活性;(2)RSV在交感中樞RVLM是能否來(lái)調(diào)節(jié)ACE2的表達(dá)和活性,能否對(duì)TIMP3/ADAM17通路產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用;(3)在PC-12細(xì)胞中干擾TIMP3的表達(dá),能否拮抗RSV對(duì)ADAM17和ACE2調(diào)節(jié)作用�！狙芯糠椒ā繉�(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性正常血壓Wistar Kyoto(WKY)大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rat,SHR),動(dòng)物體重在250-330g之間,細(xì)胞模型為PC-12細(xì)胞系。通過(guò)第四腦室灌流RSV對(duì)大鼠中樞施行持續(xù)定量給藥,使用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠血壓,使用腦定位微透析法對(duì)RVLM的細(xì)胞外液進(jìn)行收集,采用WKY第四腦室灌流AngⅡ來(lái)確定其對(duì)RVLM內(nèi)ADAM17和ACE2的影響,使用免疫熒光共聚焦法檢測(cè)RVLM神經(jīng)元ADAM17的表達(dá),使用淬滅熒光底物檢測(cè)腦組織及腦脊液中的ACE2活性。用AngⅡ誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞下調(diào)ACE2的表達(dá),使用TIMP-siRNA干擾來(lái)確定RSV是否通過(guò)ADAM17/TIMP3通路來(lái)調(diào)節(jié)ACE2,通過(guò)Western blot檢測(cè)RVLM和細(xì)胞內(nèi)ACE2等蛋白的表達(dá)變化,使用Elisa法檢測(cè)RVLM組織內(nèi)AngⅡ和Ang-(1-7)的含量【結(jié)果】一、高血壓大鼠RVLM前交感神經(jīng)元ADAM17表達(dá)增加免疫熒光檢測(cè)顯示大鼠RVLM前交感神經(jīng)元存在ADAM17的表達(dá);通過(guò)Western Blot檢測(cè)大鼠ADAM17蛋白表達(dá)顯示:SHR組的RVLM內(nèi)ADAM17表達(dá)顯著高于對(duì)照組WKY組(P0.05,n=5)。二、AngⅡ通過(guò)TIMP3/ADAM17途徑下調(diào)RVLM內(nèi)ACE2的功能(一)AngⅡ減弱RVLM細(xì)胞上ACE2功能而增強(qiáng)RVLM細(xì)胞外液ACE2活性。WKY第四腦室分別灌流人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,aCSF)和AngⅡ一周。相比灌流aCSF,灌流AngⅡ一周后平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure,MAP)和心率(heart rate,HR)顯著增高[MAP:113±4 vs.151±4 mmHg;HR:360±5 vs.395±6beats/min(BPM),P0.05,n=5],使用試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本ACE2活性發(fā)現(xiàn):灌流AngⅡ的WKY組(WKY+AngⅡ)RVLM組織內(nèi)ACE2活性低于對(duì)照組(WKY+aCSF)的活性(454±44.7 vs.180±73.2 AFU/μg/min,P0.05,n=5),而RVLM的細(xì)胞外液(腦脊液)ACE2活性顯著高于對(duì)照組(1370±470 vs.0 AFU/ml/min,P0.05,n=5)。Western Blot檢測(cè)顯示:灌流AngⅡ的WKY組RVLM組織內(nèi)ACE2表達(dá)顯著低于對(duì)照組(WKY+aCSF)。(二)AngⅡ減少RVLM組織內(nèi)TIMP3表達(dá)并增加ADAM17表達(dá)。Western Blot檢測(cè)顯示:灌流AngⅡ的WKY-RVLM內(nèi)ADAM17表達(dá)水平高于對(duì)照組(WKY+aCSF),而TIMP3的表達(dá)水平則低于對(duì)照組。三、中樞白藜蘆醇(RSV)通過(guò)TIMP3/ADAM17通路上調(diào)高血壓大鼠RVLM內(nèi)ACE2功能第四腦室灌流實(shí)驗(yàn)分成四組WKY+aCSF、WKY+RSV、SHR+aCSF和SHR+RSV。(一)中樞RSV降低高血壓大鼠的血壓。SHR第四腦室灌流RSV(SHR+RSV)后,第5天血壓開始下降,約在第7天下降至最低值后趨于平緩穩(wěn)定,與對(duì)照組SHR+aCSF相比,SHR+RSV組血壓顯著下降(161±2 vs.143±2 mmHg,P0.05,n=5)。而WKY的血壓與灌藥前相比無(wú)明顯變化(P0.05,n=5)。(二)RSV增加高血壓大鼠RVLM組織ACE2活性,并減少RVLM細(xì)胞外液ACE2活性。使用試劑盒分別檢測(cè)腦組織和透析液中的ACE2活性顯示:SHR+aCSF組RVLM內(nèi)細(xì)胞外液(腦脊液)的ACE2活性顯著高于WKY+aCSF(1455±287 vs.0 AFU/ml/min,P0.05,n=8)而RVLM組織內(nèi)的活性則顯著低于WKY+aCSF組(291±13.2 vs.464.0±48.5 AFU/μg/min,P0.05,n=8);灌流RSV組的高血壓大鼠(SHR+RSV)RVLM腦脊液中ACE2活性含量較對(duì)照組(SHR+aCSF)顯著降低(607±48.3 vs.1455±287AFU/ml/min,P0.05,n=8),而RVLM組織內(nèi)ACE2的活性則顯著升高(399±12.8 vs.291±13.2 AFU/μg/min,P0.05,n=8)。(三)RSV增加高血壓大鼠RVLM內(nèi)Ang-(1-7)的含量并減少AngⅡ的含量。通過(guò)Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組中Ang-(1-7)和AngⅡ的含量發(fā)現(xiàn):SHR+aCSF組AngⅡ含量顯著高于WKY+aCSF組(19.6±1.73 vs.9.26±0.72 pg/μg,P0.05,n=6);而Ang-(1-7)的含量則顯著低于WKY+aCSF組(2.25±0.18 vs.4.48±0.44 pg/μg,P0.05,n=6);灌流RSV組的高血壓大鼠(SHR+RSV)RVLM內(nèi)AngⅡ含量較對(duì)照組(SHR+aCSF)顯著降低(13.7±1.38 vs.19.6±1.73 pg/μg,P0.05,n=6),而Ang-(1-7)的含量則顯著升高(3.95±0.172vs.2.25±0.18 pg/μg,P0.05,n=6)。SHR+aCSF組Ang-(1-7)/AngⅡ的比值顯著低于WKY+aCSF(P0.05),灌流RSV的SHR+RSV組Ang-(1-7)/AngⅡ的比值顯著高于SHR+aCSF(P0.05)。(四)中樞灌流RSV可以顯著增加高血壓大鼠RVLM內(nèi)ACE2的表達(dá)。灌流一周后,SHR+aCSF組ACE2表達(dá)水平顯著低于WKY+aCSF組,而灌流RSV組(SHR+RSV)的高血壓大鼠ACE2表達(dá)水平較對(duì)照組(SHR+aCSF)明顯升高。(五)RSV增加SHR-RVLM內(nèi)TIMP3表達(dá)并減少ADAM17表達(dá)。Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn):SHR+aCSF組RVLM內(nèi)ADAM17蛋白的表達(dá)水平顯著高于WKY+aCSF組,而TIMP3蛋白的表達(dá)水平則顯著低于WKY+aCSF組。高血壓大鼠灌流RSV組(SHR+RSV)ADAM17表達(dá)水平較對(duì)照組(SHR+aCSF)顯著降低,而TIMP3的表達(dá)水平則顯著升高,而WKY兩組之間的TIMP3和ADAM17蛋白表達(dá)則無(wú)顯著變化。四、PC-12細(xì)胞中RSV通過(guò)TIMP3/ADAM17途徑上調(diào)ACE2表達(dá)(一)AngⅡ增加PC-12細(xì)胞ADAM17表達(dá)水平并減少ACE2表達(dá)水平。使用AngⅡ100 nM和1000 nM兩個(gè)濃度對(duì)分化后的PC-12細(xì)胞處理24小時(shí),提取細(xì)胞蛋白,Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比100 nM和1000 nM AngⅡ處理細(xì)胞可以顯著下調(diào)ACE2表達(dá)并顯著增加ADAM17表達(dá),而100 nM與1000 nM兩個(gè)濃度之間無(wú)顯著差異。(二)RSV處理可以減弱AngⅡ?qū)C12細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,增加ACE2和TIMP3表達(dá),減少ADAM17的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為四組,Control+DMSO、Control+RSV、AngⅡ+DMSO和AngⅡ+RSV,提取細(xì)胞蛋白,Western Blot顯示:AngⅡ+RSV組的ACE2和TIMP3的表達(dá)顯著高于AngⅡ+DMSO組,而ADAM17表達(dá)則低于AngⅡ+DMSO組,但Control+RSV和Control+DMSO組的各蛋白表達(dá)則無(wú)明顯差別。(三)PC-12細(xì)胞上干擾TIMP3表達(dá),拮抗RSV對(duì)AngⅡ上調(diào)ACE2表達(dá)的作用。實(shí)驗(yàn)分成三組,PC-12細(xì)胞均在AngⅡ誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上進(jìn)行處理,陰性對(duì)照組(Negative Control,NC),第二組為RSV處理的對(duì)照組(NC+RSV),第三組為TIMP-siRNA干擾的RSV處理組(siRNA+RSV),Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn):相對(duì)于NC組,NC+RSV組TIMP3和ACE2表達(dá)水平顯著增高,ADAM17表達(dá)水平則顯著降低;而相對(duì)于NC+RSV組,siRNA+RSV組ACE2和TIMP3的表達(dá)顯著降低,ADAM17表達(dá)顯著增加�！窘Y(jié)論】高血壓大鼠RVLM內(nèi)ACE2表達(dá)與活性的下降與增多的中樞AngⅡ誘導(dǎo)的ADAM17功能增強(qiáng)相關(guān),而中樞RSV通過(guò)TIMP3/ADAM17增加SHR-RVLM內(nèi)ACE2的表達(dá)和活性,改善心血管功能,本研究揭示高血壓中樞ACE2調(diào)節(jié)的新機(jī)理,為高血壓的防治策略提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R544.1
【部分圖文】：

前高血壓導(dǎo)致的包括冠心病、心力衰竭、腦卒中、腎臟疾病在內(nèi)的并發(fā)癥致死和致殘率很高[3]，給我國(guó)家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。目前有效降低血壓仍是防治高血壓病的首要策略[4]，有研究證實(shí)，降壓治療可分別降低心肌梗死風(fēng)險(xiǎn) 20%~25%、腦卒中風(fēng)險(xiǎn)35%~40%、心力衰竭風(fēng)險(xiǎn) 50%以上。因此，高效的預(yù)防和控制血壓是減少我國(guó)心血管疾病乃至心腦血管事件發(fā)生率的有效辦法。雖然目前針對(duì)高血壓的藥物已取得了重大進(jìn)展[5]，而我國(guó)高血壓的控制率為 17%[6]。因此，對(duì)高血壓發(fā)病機(jī)理的研究和尋找更高效的治療策略，仍是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。原發(fā)性高血壓病的發(fā)病原因很多[7]，而交感神經(jīng)活動(dòng)的異常增高的是其中一個(gè)重要的病因，也有研究表明，高血壓的形成與發(fā)展與交感中樞功能異常密切相關(guān)[8]。腦干的頭端延髓腹外側(cè)區(qū)（rostral ventrolateral medulla, RVLM）是血壓和交感調(diào)控的心血管調(diào)節(jié)中樞，它不僅承接著孤束核和室旁核等其它心血管調(diào)節(jié)中樞的神經(jīng)沖動(dòng)傳入，同時(shí)其所含有的前交感神經(jīng)元的纖維投射到脊髓中間外側(cè)柱，與交感神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元發(fā)生單突觸聯(lián)系，調(diào)節(jié)外周血管、腎臟和心臟等心血管活動(dòng)，從而調(diào)節(jié)控制血壓。因此，RVLM 在血壓和心血管功能的中樞調(diào)節(jié)中起到了關(guān)鍵作用，與原發(fā)性高血壓病發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切[8]。

中樞 ADAM17 介導(dǎo)膜上 ACE2 脫落在高血壓心血管功能調(diào)控中的作用研外，也有研究表明活性氧參與 AngⅡ?qū)?ADAM17 的調(diào)控，在 p47phox敲除的小鼠可少 AngⅡ引起的心肌 ADAM17 的磷酸化和激活，并保持其 ACE2 的水平，最終緩ngⅡ誘導(dǎo)的心臟功能紊亂和肥大[27]。組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 3（tissue inhibitoretalloproteinases-3 ，TIMP3）是 ADAM17 的天然的內(nèi)源性抑制劑，它可以抑制DAM17 介導(dǎo)的胞外域脫落。有研究報(bào)道，AngⅡ誘導(dǎo)可以減少心肌 TIMP3 表達(dá)增加 AngⅡ的灌流兩周不能使 TIMP3-/-小鼠的心臟肥大[28]，可見 TIMP3 參與 AngⅡ誘肌肥大的過(guò)程。中樞腦組織中存在 ADAM17 的表達(dá)[29]，其是否參與中樞特別是交樞 RVLM 內(nèi) ACE2 的調(diào)節(jié)，是否受到中樞 AngⅡ的調(diào)控，從而參與原發(fā)性高血壓的和發(fā)展，在其中發(fā)揮什么樣的作用呢，目前尚不清楚。有研究報(bào)道，白藜蘆醇（resveratSV）在人的血管平滑肌細(xì)胞中可以增加 TIMP3 表達(dá)而下調(diào) ADAM17 的功能，而果導(dǎo)的高血壓大鼠口服RSV的1周后血壓下降[30]，那么RSV是否通過(guò)TIMP3/ADAM用，增加了 ACE2 的功能從而參與血壓的調(diào)控呢，目前尚不清楚。

海軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文而降低 ACE 的表達(dá)[34]。此前，本課題組發(fā)現(xiàn)中樞第四腦室灌流 RSV 可產(chǎn)生抗高血壓效應(yīng)，ACE2 在中樞 RVLM 的變化可直接影響血壓和交感輸出,那么 RSV 在中樞是否通過(guò)調(diào)節(jié) ACE2 來(lái)調(diào)節(jié)心血管作用的呢？中樞 RVLM 內(nèi) RAS 系統(tǒng)異常是否通過(guò) ADAM17介導(dǎo)調(diào)節(jié) ACE2 的活性并參與高血壓的形成？目前尚不清楚。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 Y.UDAGWA;任新潮;;面向工程數(shù)據(jù)綜合管理——一種先進(jìn)的數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)ADAM[J];國(guó)外導(dǎo)彈與航天運(yùn)載器;1989年08期

2 殷興良;;ADAM:反衛(wèi)星和防御衛(wèi)星間對(duì)抗分析模型[J];現(xiàn)代防御技術(shù);1989年05期

3 凌家艷;沈霖;劉慶;薛莎;馬威;吳輝;李子希;朱銳;;Changes in Platelet GPIbα and ADAM17 during the Acute Stage of Atherosclerotic Ischemic Stroke among Chinese[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年03期

4 ;Role of ADAM10 and ADAM17 in CD16b Shedding Mediated by Different Stimulators[J];Chinese Medical Sciences Journal;2012年02期

5 ;ADAM17 mRNA expression and pathological features of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2004年18期

6 朱鵬程 ,桑瑛穎 ,徐人爾 ,趙t

本文編號(hào)：2832556