肺動脈高壓是一種基于不同病因和發(fā)病機(jī)制的綜合征。當(dāng)肺動脈高壓發(fā)生時,肺脈管系統(tǒng)的循環(huán)阻力逐漸增加,可能導(dǎo)致右心衰竭和死亡。肺動脈高壓的病理特征包括肺血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖和肺血管重構(gòu)。缺氧是造成肺動脈高壓的主要誘因。它會直接誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細(xì)胞的收縮和增殖,最終結(jié)果導(dǎo)致肺血管重構(gòu)。近年來的研究表明,長鏈非編碼RNA在許多生物過程中起到關(guān)鍵性作用,其中包括細(xì)胞的增殖與凋亡以及心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究顯示,長鏈非編碼RNAANRIL能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和動脈粥樣斑塊的形成。由此推測,ANRIL可能在肺動脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá),并發(fā)揮調(diào)控作用。本實(shí)驗通過實(shí)時熒光定量PCR分析在常氧和缺氧條件下,人肺動脈平滑肌細(xì)胞中ANRIL的表達(dá)變化情況。設(shè)計小干擾RNA敲低ANRIL的表達(dá)水平,通過MTT法檢測細(xì)胞活力。在敲低ANRIL的情況下,通過CCK-8檢測法分析細(xì)胞的增殖情況,用Western blot檢測增殖細(xì)胞核抗原PCNA蛋白在常氧和缺氧的細(xì)胞中表達(dá)的變化,細(xì)胞免疫熒光觀察增殖相關(guān)蛋白KI-67的表達(dá)變化,進(jìn)一步確定ANRIL對人肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的作用。通過流式細(xì)胞術(shù)分析ANRIL對人肺動脈平滑肌細(xì)胞周期的影響,探索ANRIL對人肺動脈平滑肌細(xì)胞周期的調(diào)控作用,并通過Western blot測定周期蛋白A、D、E的表達(dá)情況。分別在常氧和缺氧的情況下敲低ANRIL,通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗觀察人肺動脈平滑肌細(xì)胞遷移距離的變化,采用transwell實(shí)驗檢測人肺動脈平滑肌細(xì)胞遷移數(shù)量的變化,以探究ANRIL的沉默對缺氧誘導(dǎo)的人肺動脈平滑肌細(xì)胞遷移的作用。通過以上實(shí)驗我們發(fā)現(xiàn),ANRIL在人肺動脈平滑肌細(xì)胞中存在表達(dá)。當(dāng)給予細(xì)胞缺氧造模處理后,ANRIL的表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.01)。用小干擾RNA將ANRIL的表達(dá)敲低后,檢測到細(xì)胞活力有所增加(P0.01),說明ANRIL的表達(dá)量對人肺動脈平滑肌細(xì)胞有影響。此外,CCK-8實(shí)驗顯示,敲低ANRIL也促進(jìn)了細(xì)胞的增殖情況(P0.01),我們還檢測到PCNA的表達(dá)有所增加(P0.01),熒光顯微鏡觀察到增殖相關(guān)蛋白KI-67的表達(dá)上調(diào)。接著我們檢測了細(xì)胞周期的變化,發(fā)現(xiàn)ANRIL的沉默能夠促進(jìn)更多的人肺動脈平滑肌細(xì)胞向G2/M+S期轉(zhuǎn)移,增加了 G2/M+S期細(xì)胞的百分比(P0.05),進(jìn)而加速了細(xì)胞周期進(jìn)程。同時,周期蛋白A、D和E的表達(dá)也發(fā)生了變化,當(dāng)ANRIL表達(dá)下調(diào)時,周期蛋白的表達(dá)量增加(周期蛋白A,P0.01;周期蛋白D、E,P0.001)。這進(jìn)一步驗證了 ANRIL對細(xì)胞周期的影響。同時,低表達(dá)的ANRIL使人肺動脈平滑肌細(xì)胞的遷移距離和遷移數(shù)目均有所增加(遷移距離,P0.05;遷移數(shù)目,P0.01)。本研究首次發(fā)現(xiàn)在缺氧時,ANRIL對人肺動脈平滑肌細(xì)胞周期有影響,并能調(diào)控人肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,暗示ANRIL可能是人肺動脈平滑肌細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,并為今后發(fā)展基因靶向治療缺氧性PAH提供了研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：哈爾濱商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R544.1
【部分圖文】：

共１６邋０，冰上配置，３７邋°Ｃ溫育５邋ｍｉｎ。加入５邋ｘ邋ＲＴ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ邋ＩＩ邋４邋ｐｉ，最終得到２０逡逑０的反應(yīng)體系。放入儀器中，設(shè)置溫度３７邋°Ｃ，１５邋ｍｉｎ；邋５０邋°Ｃ，５邋ｍｉｎ；邋９８邋°Ｃ，５邋ｍｉｎ。具體逡逑步驟見圖２－１。逡逑－９－逡逑

將細(xì)胞分為陰性對照組（ｓｉ－ＮＣ）和干擾片段組（ｓｉ－ＡＮＲＩＬ）。根據(jù)實(shí)時熒光定量ＰＣＲ逡逑的數(shù)據(jù)結(jié)果分析，轉(zhuǎn)染了干擾片段組（ｓｉ－ＡＮＲＩＬ）的細(xì)胞中ＡＮＲＩＬ的表達(dá)水平比其在陰性逡逑對照組（ｓｉ－ＮＣ）的表達(dá)明顯降低（尸＜０．００１邋），如圖２－３所示。證明所設(shè)計的干擾序列能逡逑夠有效的降低ＡＮＲＩＬ在細(xì)胞中的表達(dá)量。逡逑１．５＊逡逑ｃ逡逑0逡逑Ｗ邋＊１邋0．邐逡逑０逡逑Ｑ．邐＜逡逑ＬＵ逡逑０邋０．５－邐＊＊＊逡逑．＞邐Ｔ逡逑ｒｏ邐．逡逑０逡逑＾邋ｏ．ｏ－Ｕ邐ＬＩ邐逡逑ｓｉ－ＮＣ邋ｓｉ－ＡＮＲＩＬ逡逑－１２－逡逑

逑ｓｉ－ＮＣ：陰性對照組ｓｉ－ＡＮＲＩＬ：干擾片段組逡逑圖２－３邋ＳｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染后ＡＮＲ１Ｌ的表達(dá)變化逡逑＊＊＊尸邋＜000１，ｘ士邋ｓｅｍ。逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ＡＮＲＩＬ邋ａｆｔｅｒ邋ｓｉＲＮＡ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ逡逑＜邋0．00邋１，邋ｘ邋土邋ｓｅｍ．逡逑２．４．３邋ＭＴＴ法翻ｌｊ細(xì)胞活力逡逑將細(xì)胞分別按分組要求轉(zhuǎn)染后，檢測其細(xì)胞活力。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，缺氧組和陰性對照逡逑組的細(xì)胞活力大致相同；而且與常氧組相比，以上兩組的細(xì)胞活力更高（Ｐ＜０．０１）。將干逡逑擾片段組的細(xì)胞活力與印象對照組相對比，前者的細(xì)胞活力有明顯增加（Ｐ＜邋０．０１），如圖逡逑２－４所示。說明缺氧時ＡＮＲＩＬ表達(dá)量的變化對ＨＰＡＳＭＣｓ的活力確實(shí)有影響。逡逑１．０＊ｉ邐＊＊逡逑５Ｓ邐＊＊邐逡逑＊＊？逡逑？翁邐Ｔ邋Ｔ逡逑ｇ邋０．５－逡逑Ｏ邋．逡逑ｏ．ｏ－Ｕ—ＬＩ邐Ｕ—Ｕ—Ｌ逡逑ＣＯＮ邋ＨＹＰ邋ｈｙｐ＋ｓｉ－ＮＣ邋ｈｙｐ＋ｓｉ－ＡＮＲＩＬ逡逑ＣＯＮ：常氧組ＨＹＰ：缺氧組逡逑ｈｙｐ邋＋邋ｓｉ－ＮＣ：缺氧＋陰性對照組ｈｙｐ邋＋邋ｓｉ－ＡＮＲＩＬ：缺氧＋干擾片段組逡逑圖２－４邋ＡＮＲＩＬ對細(xì)胞活力的作用逡逑＊＊Ｐ＜０．０１，邋ｘ土邋ｓｅｍ0逡逑Ｆｉｇ．邋２－４邋Ｔｈｅ邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＡＮＲＩＬ邋ｏｎ邋Ｃｅｌｌ邋Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ逡逑＊＊Ｐ＜０．０１，ｘ邋士邋ｓｅｍ．逡逑２．５本章小結(jié)逡逑本實(shí)驗將ＨＰＡＳＭＣｓ分別進(jìn)行常氧和缺氧培養(yǎng)造模。設(shè)計了邋ＡＮＲＩＬ的ＰＣＲ引物。造模逡逑完成后提取細(xì)胞總ＲＮＡ并逆轉(zhuǎn)錄。通過實(shí)時熒光定量ＰＣＲ法

【參考文獻(xiàn)】

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1 張曉丹;楊艷南;王淑靜;朱大嶺;王力維;盛潔靜;宋莎莎;;葛根素對PI3K/AKT通路介導(dǎo)PASMCS凋亡的影響[J];中國中藥雜志;2015年15期

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3 張曉丹;孫鵬;朱大嶺;謝楠;;牛磺酸抑制缺氧誘導(dǎo)大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[J];中國中藥雜志;2014年10期

4 郭耀磊;吳炳祥;;內(nèi)皮素1受體拮抗劑在先天性心臟病相關(guān)肺動脈高壓治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2013年09期

本文編號：2832183