再生障礙性貧血(Aplastic anemia,AA),是由多種原因?qū)е碌脑煅杉?xì)胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)和/或造血微環(huán)境損傷,繼而出現(xiàn)正常骨髓組織脂肪化、功能異常,血液中全血細(xì)胞減少的綜合征,臨床主要表現(xiàn)為貧血,感染和出血。再障是一個比較罕見的血液疾病,在中國發(fā)病率約為0.765/10萬,在西方國家發(fā)病率低于亞洲地區(qū),約為0.2/10萬,患者以青少年居多。再障尤其是重型再障(severe aplastic anemia,SAA)是一種病死率極高的疾病,大多數(shù)病人因接觸毒物或免疫異常有關(guān),近年來呈明顯增加趨勢。再障臨床及病理表現(xiàn)較為典型,在患者就診時結(jié)合詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)室檢查不難加以診斷。目前臨床上采用的治療方案包括骨髓干細(xì)胞移植,免疫抑制治療以及支持治療,隨著近年來治療手段的進(jìn)步,再障患者的生存率得到了一定的提升,但仍然存在著巨大的挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)主要表現(xiàn)為:(1)由于再障是一種罕見病,臨床上較難開展大樣本的隨機(jī)對照研究,一定程度上限制了治療手段的進(jìn)步。(2)有相當(dāng)一部分病人由于HLA配型失敗無法進(jìn)行骨髓干細(xì)胞移植。(3)免疫抑制治療藥物屬于大分子藥物,只對約50%的病人顯效,同時作用靶點(diǎn)廣泛、不具有選擇性,導(dǎo)致副作用較大,包括正常的免疫功能受到抑制,繼發(fā)性腫瘤以及嚴(yán)重的肝腎毒性等。(4)干細(xì)胞移植、免疫抑制劑、輸血等治療手段費(fèi)用昂貴,不適合我國國情。尋求經(jīng)濟(jì)安全的再障治療藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。近年來隨著生物信息學(xué)和藥物基因組學(xué)的迅猛發(fā)展,“大數(shù)據(jù)”分析成為醫(yī)學(xué)科研和藥物研發(fā)的有效手段,尤其對于研發(fā)罕見疾病的“孤兒藥”具有非常實(shí)用和珍貴的價值。人類疾病的發(fā)生往往不是由于單個基因的改變,多是因基因組發(fā)生了異常變化的結(jié)果,而藥物治療疾病也是通過影響基因組進(jìn)行,這是藥物基因組學(xué)的核心理念。ConnectivityMap是由著名科研機(jī)構(gòu)Broad Institute開發(fā)的藥物基因組學(xué)工具,通過將藥物相關(guān)的基因組和疾病特征性的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對分析,篩選出可能治療疾病的小分子化合物。我們利用互聯(lián)網(wǎng)開放資源檢索到再障發(fā)病相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù),通過ConnectivityMap進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)小分子化合物L(fēng)S001可能具有治療再障的作用。LS001作為小分子化合物,臨床上已經(jīng)用來治療其他疾病,具有成本低、副作用小的優(yōu)點(diǎn)。目前尚未有關(guān)于LS001與再障相關(guān)的研究,但最新研究表明LiverKinase B1(LKB1)是造血干細(xì)胞(hemopoietic stem cell,HSC)維持造血的必要條件,而LS001與LKB1具有密切的關(guān)聯(lián)。本課題試圖在整體水平和細(xì)胞水平證實(shí)LS001對再障的保護(hù)作用;闡明藥物保護(hù)作用的分子機(jī)制。提出假說:LS001通過LKB1-MARK2信號通路治療再障。據(jù)此假設(shè),我們進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如下:實(shí)驗(yàn)一:預(yù)測LS001對再障具有治療作用在Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫中檢索到再障病人基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)GSE3807;通過GeneSpring GX軟件對GSE3807進(jìn)行差異表達(dá)基因分析,發(fā)現(xiàn)與健康志愿者比較,再障病人有515個基因發(fā)生了顯著的差異表達(dá),其中上調(diào)基因202個,下調(diào)基因313個;使用ConnectivityMap在線平臺分析預(yù)測LS001可能具有治療再障的作用。實(shí)驗(yàn)二:LS001在整體水平能夠治療再障~(60)Co-γ射線7.0Gy輻照ICR小鼠后給予300 mg/kg劑量的LS001能夠顯著延長小鼠生存時間(Log-rank P0.05)。相比生理鹽水對照組小鼠,給藥組小鼠血小板計(jì)數(shù)顯著提升(1286±135×10~9/l vs 1055±143×10~9/l,P0.01),未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞比例顯著提高(10.31±9.83%vs 2.53±3.85%,P0.01),骨髓有核細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P0.01),骨髓造血面積顯著恢復(fù)(P0.05)。實(shí)驗(yàn)三:LS001在細(xì)胞水平能夠治療再障~(60)Co-γ射線8.0Gy輻照原代骨髓細(xì)胞后給予1 mM劑量的LS001能夠顯著顯著降低細(xì)胞凋亡比例,流式細(xì)胞術(shù)測得結(jié)果23.5±3.8%vs 39.3±5.6%(P0.01)。實(shí)驗(yàn)四:LS001對再障治療依賴于LKB1~(60)Co-γ射線6.5 Gy輻照lkb1基因敲除小鼠后給予300 mg/kg劑量的LS001,野生型小鼠中給藥能夠顯著延長小鼠生存時間(Log-rank P0.01);純合子小鼠中給藥不能延長小鼠生存時間(Log-rank P0.05)。~(60)Co-γ射線6.5 Gy輻照lkb1基因敲除小鼠后給予300 mg/kg劑量的LS001,血常規(guī)檢測示LS001未能改善lkb1(-/-)小鼠PLT計(jì)數(shù)(986±216×10~9/l vs 965±205×10~9/l,P0.05);未能改善lkb1(-/-)小鼠RET比例(0.19±0.08%vs 0.20±0.05%,P0.05)。血常規(guī)檢測示LS001能顯著改善lkb1(+/+)小鼠血小板計(jì)數(shù)(PLT 1628±97×10~9/l vs1395±202×10~9/l,P0.05);能顯著改善lkb1(+/+)小鼠RET比例(0.45±0.10%vs0.30±0.06%,P0.01)。正常ICR小鼠取骨髓進(jìn)行原代骨髓細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后在30 min,1 h,2 h,3 h,6 h,12 h及24 h不同時間點(diǎn)分別給藥。WB檢測LKB1及p-LKB1表達(dá)發(fā)現(xiàn),與內(nèi)參GAPDH表達(dá)相比,LKB1在各個時間點(diǎn)表達(dá)未發(fā)生顯著變化,p-LKB1的表達(dá)在30 min即發(fā)生顯著提高,在給藥后約6 h達(dá)到表達(dá)高峰,隨后表達(dá)逐漸降低。實(shí)驗(yàn)五:LKB1對再障的保護(hù)作用不依賴于AMPKMeg01細(xì)胞待生長至一定密度后給藥組分別給予0.1 mM及1 mM的LS001,對照組給予等體積PBS,24 h后收集裂解細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀。結(jié)果顯示:LS001隨濃度增加使LKB1-AMPKα2結(jié)合顯著增加,但不影響LKB1-AMPKα1的結(jié)合。在證實(shí)二者能夠發(fā)生相互作用后,我們利用ampkα2基因敲除小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證AMPKα2是否參與對再障的保護(hù)作用。~(60)Co-γ射線6.5 Gy輻照ampkα2基因敲除小鼠后給予300 mg/kg劑量的LS001,血常規(guī)檢測示LS001能夠改善ampkα2(-/-)小鼠PLT計(jì)數(shù)(1243±106×10~9/l vs 936±99×10~9/l,P0.01);能改善ampkα2(-/-)小鼠RET比例(0.29±0.06%vs 0.21±0.05%,P0.01)。同時血常規(guī)檢測示LS001能顯著改善ampkα2(+/+)小鼠血小板計(jì)數(shù)(PLT 1533±85×10~9/l vs 1310±132×10~9/l,P0.01);能顯著改善ampkα2(+/+)小鼠RET比例(0.51±0.10%vs 0.33±0.06%,P0.01)。實(shí)驗(yàn)六:LKB1對再障的保護(hù)作用依賴于MARK2,不依賴于MARK3Meg01細(xì)胞轉(zhuǎn)染lv-GFP,lv-MARK2,lv-MARK3過表達(dá)慢病毒,~(60)Co-γ射線10.0Gy輻照后24 h后行Annexin-V/PI染色,1 h內(nèi)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,與lv-GFP對照組相比,過表達(dá)MARK2可顯著降低Meg01細(xì)胞的凋亡比例(21.2±2.3%vs38.6±7.5%,P0.01);過表達(dá)MARK3不能降低Meg01細(xì)胞的凋亡比例(37.3±7.3%vs38.6±7.5%,P0.05)。Meg01細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-Scramble,sh-MARK2,sh-MARK3干擾慢病毒,~(60)Co-γ射線10.0 Gy輻照后24 h后行Annexin-V/PI染色,1 h內(nèi)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,與PBS+sh-MARK2組相比,LS001+sh-MARK2不能顯著降低Meg01細(xì)胞的凋亡比例(42.9±2.5%vs 40.1±3.4%,P0.05)。實(shí)驗(yàn)七:LKB1與MARK2的相互作用關(guān)系Meg01細(xì)胞待生長至一定密度后給藥組分別給予0.1 mM及1 mM的LS001,對照組給予等體積PBS,24 h后收集裂解細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀。結(jié)果顯示:LS001隨濃度增加使LKB1-MARK2結(jié)合顯著增加。Mark2基因敲除小鼠,野生型及純合子分別取骨髓,行骨髓原代細(xì)胞培養(yǎng),24 h后后分別用lv-GFP,lv-LKB1慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,待病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后,10 Gy輻照造模。與野生型MARK2+lv-GFP組相比,野生型MARK2+lv-GFP組的細(xì)胞凋亡比例顯著降低(流式:24.2±2.2%vs 30.1±1.9%,P0.01)。與純合子MARK2+lv-GFP組相比,純合子MARK2+lv-GFP組的細(xì)胞凋亡比例無顯著變化(流式:43.5±5.7%vs 42.2±6.3%,P0.05)。實(shí)驗(yàn)八:LS001涉及到的細(xì)胞凋亡的初步機(jī)制研究。5只ICR小鼠,取骨髓細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),待細(xì)胞長至合適密度后,分為兩組,即對照組和輻照組。輻照劑量為7.0 Gy。24 h后提取細(xì)胞總蛋白,測定凋亡信號的表達(dá)情況。輻照造模后,線粒體通路的Bax,Bcl2以及死亡受體通路的Cle-caspase8的表達(dá)無明顯變化;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的Cle-caspase12及凋亡終末信號Cle-caspase3的表達(dá)顯著上升。MARK2基因敲除小鼠野生型和純合子各4只,取骨髓細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),待細(xì)胞長至合適密度后,分為兩組,即對照組和輻照組,兩組造模前再分別給予PBS和LS001。輻照劑量為6.5 Gy。24 h后提取細(xì)胞總蛋白,測定凋亡信號的表達(dá)情況。MARK2野生型小鼠給藥后,骨髓細(xì)胞的Cle-caspase12和Cle-caspase3的表達(dá)均顯著下降。而在MARK2純合子小鼠給藥后,Cle-caspase12和Cle-caspase3的表達(dá)無明顯變化。LKB1基因敲除小鼠純合子4只,取骨髓細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),待細(xì)胞長至合適密度后,分為三組,即對照組,lv-GFP組和lv-MARK2組,待病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)后造模。輻照劑量為6.5 Gy。輻照24 h后提取細(xì)胞總蛋白,測定凋亡信號的表達(dá)情況。LKB1基因敲除小鼠純合子骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)MARK2病毒,輻照造模后,骨髓細(xì)胞的Cle-caspase12和Cle-caspase3的表達(dá)均顯著下降。MARK2基因敲除小鼠純合子4只,取骨髓細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),待細(xì)胞長至合適密度后,分為三組,即對照組,lv-GFP組和lv-LKB1組,待病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)后造模。輻照劑量為6.5 Gy。輻照24 h后提取細(xì)胞總蛋白,測定凋亡信號的表達(dá)情況。MARK2基因敲除小鼠純合子骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)LKB1病毒,輻照造模后,骨髓細(xì)胞的Cle-caspase12和Cle-caspase3的表達(dá)無明顯變化。結(jié)論:(一)LS001對再障具有確切保護(hù)作用。(二)LS001對再障的保護(hù)作用依賴于LKB1-MARK2通路。(三)LS001對再障的保護(hù)作用通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的Cle-caspase12及凋亡終末信號Cle-caspase3。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R556.5
【部分圖文】：

克隆載體pLenO-DCE圖譜

目的基因慢病毒載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程圖

圖 3.慢病毒載體系統(tǒng)質(zhì)粒圖譜病毒包裝流程病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，四種質(zhì)粒載體分別提，共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 8 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)

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本文編號：2826702