背景:缺氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是慢性阻塞性肺疾病和高原心臟病等疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。慢性缺氧最終會導(dǎo)致肺血管重建,此過程伴隨著肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)從具收縮能力的分化表型向強(qiáng)增殖能力的合成表型的轉(zhuǎn)換。近年來研究表明,micro RNA(mi RNA)通過影響PASMCs的分化、增殖、遷移和凋亡等方面,在肺血管重建中起重要的調(diào)控作用。然而,目前對于mi RNA在缺氧條件下調(diào)控PASMCs的分子機(jī)制的認(rèn)識仍然十分有限。目的:研究mi R-20a在缺氧誘導(dǎo)的人肺動脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用及調(diào)控機(jī)制。方法和結(jié)果:首先,通過定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)mi R-20a在缺氧誘導(dǎo)的肺高壓小鼠的肺組織和肺動脈中的表達(dá)顯著上調(diào);對體外培養(yǎng)的人肺動脈平滑肌細(xì)胞(human pulmonary arterial smooth muscle cells,HPASMCs)進(jìn)行缺氧處理,發(fā)現(xiàn)mi R-20a的表達(dá)也顯著上調(diào);在HPASMCs中分別過表達(dá)或抑制mi R-20a,通過Ed U摻入實驗、劃痕實驗及western blot方法分析其對HPASMCs功能的影響,發(fā)現(xiàn)mi R-20a能夠抑制分化表型蛋白calponin、α-SMA、Smoothelin、MHC和SM-22的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移;以上結(jié)果表明mi R-20a在缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs中表達(dá)上調(diào),并促進(jìn)細(xì)胞向去分化表型轉(zhuǎn)換。其次,通過定量PCR和western blot方法,驗證了與HPASMCs分化表型維持密切相關(guān)的c GMP依賴性蛋白激酶1(PKG 1)的m RNA和蛋白表達(dá)在缺氧條件下均顯著下調(diào);通過western blot檢測發(fā)現(xiàn)在HPASMCs中過表達(dá)或抑制mi R-20a能夠分別下調(diào)或上調(diào)PKG 1的蛋白表達(dá)水平,提示PKG 1可能是mi R-20a的靶基因;通過雙熒光素酶報告基因分析,發(fā)現(xiàn)mi R-20a對PKG 1的3’-UTR及啟動子沒有明顯的調(diào)控作用,進(jìn)一步分析PKG 1的編碼序列,通過定點突變和western blot檢測,證明mi R-20a通過靶向PKG 1編碼區(qū)的兩個高保守的識別位點,在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制其蛋白表達(dá);細(xì)胞功能實驗結(jié)果表明,PKG 1能夠促進(jìn)分化表型蛋白的表達(dá),并抑制細(xì)胞的增殖和遷移,使細(xì)胞向分化表型轉(zhuǎn)換;此外,通過定量PCR檢測先天性心臟病相關(guān)的肺動脈高壓患者血清中的mi RNA變化,發(fā)現(xiàn)mi R-20a的表達(dá)顯著上調(diào),提示其可能作為潛在的循環(huán)標(biāo)志物在肺動脈高壓的臨床診斷中發(fā)揮作用。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了mi R-20a在缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs中表達(dá)上調(diào),證明了其通過靶向PKG1編碼區(qū)抑制其蛋白表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移,使細(xì)胞向去分化表型轉(zhuǎn)換。研究結(jié)果不僅揭示了缺氧下調(diào)PKG 1的表達(dá)及促進(jìn)HPASMCs表型轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制,也為肺動脈高壓的臨床診斷和治療提供了新思路。
【學(xué)位單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R544.1

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本文編號：2823628