近年來,心腦血管疾病發(fā)病率呈上升趨勢。2012年世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,全球每年因心血管疾病死亡人數(shù)高達(dá)1740萬,成為威脅人類健康的最重要疾病之一。心肌缺血、缺氧多見于心臟冠脈供血不足或高原缺氧環(huán)境等情形,若缺血、缺氧持續(xù)存在,則會(huì)導(dǎo)致心肌損傷,影響心臟功能。因此,心肌缺血、缺氧性疾病的發(fā)生發(fā)展及防治措施研究,一直是心血管疾病研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled-receptor,GPCR)是位于細(xì)胞膜的蛋白分子,結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為跨膜七次,激活時(shí)與胞內(nèi)的G蛋白分子發(fā)生偶聯(lián),是迄今為止最重要的藥物發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)。GPCR配基的種類較多,包括生物胺、肽類、脂類、氨基酸、氣味等,但糖代謝中間產(chǎn)物也能成為GPCR的特異配基令人頗感意外。琥珀酸(鹽)是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,直至將它鑒定為GPCR成員GPR91(G protein-coupled receptor 91)的特異性配基,才賦予了它更重要的角色,預(yù)示著琥珀酸(鹽)不僅參與能量代謝過程,而且具有相應(yīng)的生理功能和病理意義。有研究認(rèn)為,在肝臟供血不足時(shí)血壓升高與琥珀酸的血液濃度增加有關(guān),同時(shí)琥珀酸還參與了腎素釋放的調(diào)節(jié)而導(dǎo)致血壓升高。最新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟組織中亦存在大量GPR91表達(dá),提示GPR91很可能與心臟功能密切相關(guān)�；谝陨涎芯勘尘�,本課題主要開展了兩部分的研究工作:第一部分,利用冠脈結(jié)扎所致大鼠心肌缺血模型及模擬高原環(huán)境所致大鼠心肌低氧模型,研究在缺血、缺氧情況下GPR91的mRNA及蛋白的表達(dá)變化及大鼠心肌組織的病理改變;第二部分,體外培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞,制備低氧培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞模型,通過siRNA干擾技術(shù)降低細(xì)胞內(nèi)GPR91的表達(dá),觀察原代心肌細(xì)胞的生存狀態(tài)及心肌損傷BNP、PI3K、下游信號(hào)分子Akt及磷酸化改變,驗(yàn)證GPR91是否參與心肌缺血、缺氧病理改變過程。第一部分:制備冠脈結(jié)扎所致大鼠心肌缺血模型及模擬高原環(huán)境所致大鼠心肌低氧模型,通過PCR和Western blot檢測GPR91的mRNA及蛋白的表達(dá)變化水平。為了誘發(fā)心肌缺血大鼠模型,將大鼠心臟左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎一定時(shí)間,同時(shí)設(shè)置假手術(shù)組,即結(jié)扎線僅穿過左冠狀動(dòng)脈前降支但不進(jìn)行結(jié)扎。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組大鼠的心肌組織相比,冠狀動(dòng)脈結(jié)扎12h、24h組大鼠GPR91的mRNA和蛋白表達(dá)水平,均出現(xiàn)明顯上調(diào)(P0.01、P0.05)。模擬高原環(huán)境所致大鼠心肌低氧模型中,與正常氣壓組相比,低氣壓1d、3d、5d和7d組大鼠心肌細(xì)胞中GPR91的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P0.05),且其蛋白表達(dá)水平在7d后也明顯升高(P0.05);通過分析心肌組織病理切片,低氣壓1d組心肌細(xì)胞出現(xiàn)變性腫脹,3d及5d可見炎性細(xì)胞浸潤,7d后可見心肌變性腫脹斷裂,胞核不清。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,低氧環(huán)境大鼠心肌組織GPR91的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢,表明GPR91參與了心肌缺血、缺氧損傷的病理過程。第二部分:我們首先原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞,予以低氧處理,再利用siRNA干擾技術(shù)降低細(xì)胞內(nèi)GPR91的表達(dá),觀察心肌細(xì)胞的存活狀態(tài)及PI3K/Akt通路的變化。低氧環(huán)境下可見心肌細(xì)胞存活率降低,ATP含量減少,BNP及CaMK II表達(dá)上調(diào);較之對(duì)照組,siRNA干擾組心肌細(xì)胞GPR91的表達(dá)水平被抑制,與此同時(shí),還可檢測到心肌細(xì)胞存活率上升、ATP含量增多、BNP及CaMK II蛋白表達(dá)下調(diào)、PI3K及下游信號(hào)分子Akt磷酸化水平降低(P0.05)。提示GPR91可能通過調(diào)控PI3K-Akt的磷酸化介入了心肌缺血損傷的病理過程。綜上所述,本研究從體內(nèi)和體外兩方面證實(shí),GPR91與缺血、缺氧引發(fā)的心肌損傷有關(guān),介入了后者的發(fā)生發(fā)展過程,且這一影響可能是GPR91通過調(diào)控PI3K-Akt的磷酸化進(jìn)而參與心肌缺血損傷的病理過程實(shí)現(xiàn)的。本研究對(duì)于探討冠狀動(dòng)脈供血不足、高原環(huán)境缺氧所致的心肌疾病的防治,具有較強(qiáng)的理論和現(xiàn)實(shí)意義,同時(shí)也為靶向GPR91藥物的發(fā)現(xiàn)研究提供了依據(jù)。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R542.2
【部分圖文】：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：BSA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μ g/ml） 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 稀釋液（μ l） 0 25 25 25 25 25 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品（μ l 25 25 0 0 0 0 標(biāo)曲濃度（μ g/ml） 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 0標(biāo)曲 OD 值 0.526 0.327 0.227 0.173 0.147 0.132 0.12標(biāo)曲 OD 值 0.469 0.340 0.229 0.186 0.148 0.134 0.12均值 0.498 0.334 0.228 0.180 0.148 0.133 0.12校準(zhǔn)值 0.371 0.207 0.101 0.053 0.021 0.006 0.00根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及標(biāo)準(zhǔn)品 OD 值，可得出下列標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白含量（

圖的變化組大鼠比較，心臟冠脈結(jié)扎 12 h 及 24 h 大鼠的心電圖均出現(xiàn)現(xiàn)為 ST 段弓背型抬高，為典型的心肌缺血電生理變化。各組圖變化結(jié)果如圖 2-2 所示。

-3. 冠脈結(jié)扎心肌缺血模型大鼠心臟左心室梗死面積的變化（x s, n=3）2-3. Changes in left ventricular infarct size in rats with coronary artery ligation andmyocardial ischemia ( x±s，n=3 )血清 LDH、CK 和 cTn-T 含量的變化 2-2 結(jié)果可見，與假手術(shù)組相比，心臟冠脈結(jié)扎 12 h、24 h 組大鼠的CK 和 cTn-T 含量顯著增加（P<0.01）；與 12h 組相比，結(jié)扎 24 h H 和 cTn-T 含量亦明顯增加（P<0.01）。

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本文編號(hào)：2821236