目的明確血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)刺激誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是否與有氧糖酵解相關(guān)及其機(jī)制。方法1、細(xì)胞模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組采用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs),分組實(shí)驗(yàn)中以PDGF-BB作為刺激因子,采用糖酵解途徑的抑制劑2-脫氧葡萄糖(2-DG),將PASMCs分為空白對(duì)照組、PDGF-BB(30ng/ml)組、PDGF-BB(30ng/ml)+2-DG(10mmol/l)組;在慢病毒過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,將PASMCs分為空白對(duì)照組、PDGF-BB(30ng/ml)組、PDGF-BB(30ng/ml)+去乙�；竤irtuin-3(SIRT3)過表達(dá)組、PDGF-BB(30ng/ml)+空載體組。2、檢測相關(guān)指標(biāo)使用蛋白免疫印跡(Western Blot)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)、α-肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、鈣調(diào)蛋白(calponin)、波形蛋白(vimentin)等表型指標(biāo)的表達(dá)。使用細(xì)胞免疫熒光染色檢測α-SMA表達(dá)水平。使用EDU檢測PASMCs增殖情況。使用Western Blot檢測PDGF-BB刺激后SIRT3的表達(dá)。在慢病毒過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,使用Western Blot、qRT-PCR檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(Glut1)及有氧糖酵解酶的表達(dá)水平。結(jié)果PDGF-BB刺激12小時(shí)后,大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞合成表型指標(biāo)vimentin mRNA及蛋白水平升高(P0.05),而收縮表型指標(biāo)α-SMA、SM-MHC、calponin mRNA及蛋白表達(dá)水平則明顯降低(P均0.05),但2-DG逆轉(zhuǎn)了PDGF-BB的這種作用。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)及EDU增殖實(shí)驗(yàn)顯示,PDGF-BB減少α-SMA陽性細(xì)胞,并導(dǎo)致PASMCs顯著增殖,而2-DG可逆轉(zhuǎn)該過程。此外,PDGF-BB刺激細(xì)胞后,SIRT3蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P0.05)。慢病毒過表達(dá)SIRT3實(shí)驗(yàn)中,與空白對(duì)照組相比,PDGF-BB可顯著增加Glut1及有氧糖酵解酶己糖激酶2(HK2)、磷酸果糖激酶3(PFKFB3)mRNA及蛋白表達(dá)(P均0.05);過表達(dá)SIRT3可顯著抑制PDGF-BB對(duì)Glut1及糖酵解酶的影響(P均0.05);但PDGF-BB+空載體組Glut1和糖酵解酶的mRNA及蛋白的表達(dá)水平則與PDGF-BB組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。結(jié)論P(yáng)DGF-BB通過SIRT3促進(jìn)有氧糖酵解調(diào)控肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R544.1
【部分圖文】：

圖2.3.2 PDGF-BB通過糖酵解影響細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化（1:空白對(duì)照組，2：PDGF-BB組，3：PDGF-BB+2-D組）AWestern Blot 觀察各組表型指標(biāo)的蛋白表達(dá)水平；B qRT-PCR 觀察各組表型指標(biāo)的 mRNA 達(dá)水平：與空白對(duì)照組相比，aP 均<0.05，n=3；與 PDGF-BB 組相比，bP 均<0.05，n=3。C 各組鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞α-肌動(dòng)蛋白（α-SMA）免疫熒光染色結(jié)果（1：空白照組，2：PDGF-BB 組，PDGF-BB+2-DG 組 ×400）：綠色代表α-SMA 陽性細(xì)胞，藍(lán)色代表細(xì)胞核。與空白對(duì)照組相比，PDGF-BB 組α-SMA 陽性細(xì)胞明顯減少；與 PDGF-BB 組相比，PDGF-BB+2-DG 組α-SMA 陽性細(xì)相對(duì)增多。Figure 2.3.2 PDGF-BB affects cell phenotype transformation through glycolytic pathway2.3.3 PDGF-BB 通過糖酵解影響細(xì)胞的增殖EDU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，基于 EDU 與熒光染特異性反應(yīng)的原理，能夠快速檢測細(xì)胞 DNA 復(fù)制的活性，可適用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞化、生長發(fā)育、DNA 修復(fù)等很多方面的研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 EDU 檢測細(xì)胞增殖情況。使用糖酵解途徑的抑制劑 2-DG 干預(yù)細(xì)胞 2h，即阻斷了糖酵解途徑，再用 PDGF-BB 激細(xì)胞 12h，我們可以清楚地觀察到 PDGF-BB 組細(xì)胞增殖數(shù)高于空白對(duì)照組PDGF-BB+2-DG組細(xì)胞增殖數(shù)低于PDGF-BB組。結(jié)果證實(shí)了PDGF-BB可促進(jìn)PASM

圖 2.3.3 各組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖情況的 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EDU）染色結(jié)果（1：空白對(duì)照組，2：PDGF-BB 組，3：PDGF-BB+2-DG 組 ×400）：紅色代表 EDU 陽性細(xì)胞，藍(lán)色代表總細(xì)胞核。與空白對(duì)照組相比，PDGF-BB組EDU陽性細(xì)胞明顯增多，代表細(xì)胞增殖數(shù)增高；與PDGF-BB組相比，PDGF-BB+2-DG 組 EDU 陽性細(xì)胞明顯減少，代表細(xì)胞增殖數(shù)下降。Figue 2.3.3 EDU observes the proliferation of PASMCs2.3.4 PDGF-BB 降低 SIRT3 的表達(dá)水平SIRT3 是第一個(gè)被定位于哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體的 Sirtuin，在富含線粒體的組織中高表達(dá)。為了探究 PDGF-BB 對(duì) SIRT3 的影響，用 PDGF-BB 刺激細(xì)胞 12h，Western blot結(jié)果顯示PDGF-BB組SIRT3蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組（0.43±0.06比1.00±0.00，P < 0.05）。提示 PDGF-BB 可抑制 PASMCs 中 SIRT3 的表達(dá)水平。（圖 2.3.4）

結(jié)果顯示PDGF-BB組SIRT3蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組（0.43±0.06比1.00±0.00，P < 0.05）。提示 PDGF-BB 可抑制 PASMCs 中 SIRT3 的表達(dá)水平。（圖 2.3.4）圖2.3.4 各組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞SIRT3表達(dá)水平的Western Blot結(jié)果（1：空白對(duì)照組，2：PDGF-BB組）：與空白對(duì)照組相比，aP<0.05，n=3。Figure 2.3.4 Western Blot observes the expression level of SIRT3 protein2.3.5 慢病毒載體過表達(dá) SIRT3前期實(shí)驗(yàn)提示 PDGF-BB 刺激細(xì)胞后，SIRT3 表達(dá)水平明顯下降，并且也證實(shí)了PDGF-BB 可通過糖酵解誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化及增殖，那么 PDGF-BB、

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 邱梅紅;張銳;鄭楊;張尉華;;實(shí)驗(yàn)性肺動(dòng)脈高壓大鼠心室間糖酵解代謝相關(guān)基因篩選和差異[J];中華心血管病雜志;2014年12期

本文編號(hào)：2818385