研究背景酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy,ACM)是一種特殊的心肌病,常發(fā)生在長期大量飲酒的人群中。ACM的病理特點(diǎn)包括心肌肥厚、心肌收縮功能降低(左心室肥大、左心室射血分?jǐn)?shù)降低),心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡。研究表明血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)參與了 ACM的發(fā)病機(jī)制,降低AngⅡ水平可以減輕酒精誘導(dǎo)的心肌損傷。在心臟局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)中,AngⅡ由血管緊張素原(Angiotensinogen,AGT)通過腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶或糜蛋白酶合成。研究證據(jù)表明,在豬的心臟中,大約75%的Ang Ⅱ來自于心臟局部的血管緊張素Ⅰ的轉(zhuǎn)化,而不是血液中的血管緊張素Ⅰ。研究表明,心肌局部RAS在ACM的病理過程中發(fā)揮重要的作用。在ACM中,小鼠心肌細(xì)胞中的Ang Ⅱ誘發(fā)許多生理病理反應(yīng),包括氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡和心肌重構(gòu)。但目前在ACM中,如何減少心肌局部RAS中的AGT和Ang Ⅱ還尚不清楚。近年來,線粒體乙醛脫氫酶2(Aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)被認(rèn)為是一種重要的心肌保護(hù)酶,它能夠明顯降低缺血再灌注、糖尿病、酒精等引起的心肌損傷。研究發(fā)現(xiàn),ALDH2介導(dǎo)的包括乙醛在內(nèi)的細(xì)胞毒性醛的解毒,可能是減輕酒精損傷的保護(hù)機(jī)制。有研究表明,小鼠過表達(dá)ALDH2能夠有效的改善慢性酒精攝入引起的醛類累積、心肌肥厚和心肌收縮功能降低。另有研究發(fā)現(xiàn),在心肌肥大細(xì)胞中,由蛋白激酶Cε(Protein kinase Cε,PKCε)激活的ALDH2通過抑制心肌局部RAS可減少心肌缺血再灌注損傷后的心律失常。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ALDH2能夠改善ACM,但ALDH2是否通過抑制心肌局部RAS來改善酒精誘導(dǎo)的心肌損傷,還有待于進(jìn)一步研究。P38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAP kinase,p38 MAPK),是絲裂原活化蛋白激酶家族的成員之一,參與了多種信號(hào)傳導(dǎo)通路。cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)作為 p38 MAPK 的下游信號(hào)分子,能夠與DNA結(jié)合調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明,長期酒精攝入能夠升高大腦皮層中p38 MAPK磷酸化水平,而過表達(dá)ALDH2可以抑制這一過程。研究發(fā)現(xiàn),在ACM中,過表達(dá)ALDH2可通過降低CREB的磷酸化水平進(jìn)而抑制心肌肥厚。另一研究表明,在高糖條件下,磷酸化的p38 MAPK和CREB都能夠增加AGT表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞的肥大,但p38 MAPK并不能調(diào)控CREB。然而,在ACM中,ALDH2能否通過抑制p38 MAPK/CREB通路進(jìn)而減少心肌局部RAS中的AGT和Ang Ⅱ還有待于進(jìn)一步研究。研究目的1.探討在ACM中,ALDH2能否通過抑制心肌局部RAS改善酒精引起的心肌損傷;2.探討在ACM中,p38 MAPK/CREB通路是否參與了 ALDH2對(duì)心肌局部RAS的調(diào)控。研究方法1.小鼠ACM模型的建立8周齡的雄性C57BL/6J小鼠用Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)2個(gè)月。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組(n=10):對(duì)照組(Con)、空載體組(Vehicle)、酒精組(ETOH)、酒精+Alda-1 組(ETOH+Alda-1)、酒精+Daidzin 組(ETOH+Daidzin)。ETOH 組的小鼠使用含有5%酒精的Lieber-DeCarli液體飼料,酒精供能比例占36%。Con組和Vehicle組小鼠用不含酒精的對(duì)照液體飼料喂養(yǎng)。用Alzet滲透壓泵給小鼠持續(xù)腹腔泵入ALDH2激活劑Alda-1(10 mg/kg/天),ALDH2抑制劑Daidzin(50 mg/kg/天),維持2個(gè)月。2.心臟超聲使用Vevo770 imaging system評(píng)估小鼠心功能。1.5%的異氟烷吸入法麻醉小鼠后,在M超下檢測(cè)左心室舒張末期直徑(Left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)和左心室收縮末期直徑(Left ventricular end-systolic dimension,LVESD),并計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction,LVEF)。3.組織學(xué)和形態(tài)學(xué)心肌組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋并切片。麥胚凝集素染色(Wheat germ agglutinin,WGA)用于評(píng)估心肌纖維的橫截面積。使用Masson染色和天狼星紅染色來評(píng)估心肌纖維化水平。4.TUNEL法凋亡染色心肌組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋并切片。TUNEL染色用于評(píng)估心肌細(xì)胞凋亡。5.乳大鼠原代心肌細(xì)胞的提取和培養(yǎng)用0.05%的胰蛋白酶和0.04%的膠原酶消化并提取2日齡Wistar大鼠的原代心肌細(xì)胞。將原代心肌細(xì)胞暴露于不同劑量的酒精(10-400 mmol/L)或Ang Ⅱ(1-1000 nmol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h檢測(cè)ALDH2的表達(dá)和活性。在隨后的實(shí)驗(yàn)中,我們選擇400 mmol/L酒精作為干預(yù)條件,并在培養(yǎng)基中加入ALDH2激活劑(Alda-1,20 μmol/L),ALDH2 抑制劑(Daidzin,50 μmol/L),p38 MAPK 抑制劑(SB203580,10 μmol/L),p38 MAPK 激活劑(Anisomycin,10 μmol/L)或CREB抑制劑(KG-501,25 μmol/L)做進(jìn)一步研究。6.ALDH2腺病毒轉(zhuǎn)染將原代心肌細(xì)胞以1-2×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到六孔板中,并且以60的感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染ALDH2過表達(dá)腺病毒。通過在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的表達(dá)及免疫印跡(Western blotting)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。7.Western blotting 檢測(cè)將30μg的組織蛋白或原代細(xì)胞蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗孵育、二抗孵育、化學(xué)發(fā)光。檢測(cè) ALDH2、AGT、phospho-p38 MAPK、p38 MAPK、phospho-CREB、CREB 的表達(dá)水平。p38MAPK、CREB、GAPDH、β-tubulin 的表達(dá)水平作為內(nèi)參。8.ALDH2酶活性分析提取出的線粒體用超聲裂解后,4℃以11000 ×g的轉(zhuǎn)速超速離心10 min,取上清。通過檢測(cè)ALDH2代謝NAD+生成NADH的量反映ALDH2酶活性。9.醛類分析心肌組織或原代心肌細(xì)胞用PBS勻漿后,900 ×g離心10 min,取50μL的上清或醛類標(biāo)準(zhǔn)品(1-1000 μmol/L)加入到黑色96孔板中,加入50 μ的AldeLightTM藍(lán)色反應(yīng)液,室溫避光孵育15 min,加入25 μL的反應(yīng)緩沖液。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)Ex/Em = 365/435 nm。10.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)檢測(cè)Ang Ⅱ濃度首先用BCA法對(duì)提取出來的心肌組織蛋白或細(xì)胞蛋白定量,然后用ELISA法檢測(cè)蛋白中Ang Ⅱ的濃度。結(jié)果1.在ACM中,酒精升高心臟中AGT和Ang Ⅱ的水平動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,與Con組相比,ETOH組小鼠心肌的AGT和Ang Ⅱ分別增加了 1.4倍和1.9倍。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,10-400 mmol/L酒精引起原代心肌細(xì)胞AGT和Ang Ⅱ的增加,在400 mmol/L時(shí)增加最明顯。2.在ACM中,心臟中ALDH2活性受到抑制動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,與Con組相比,ETOH組小鼠的心肌中的ALDH2表達(dá)水平?jīng)]有變化。但是ETOH組小鼠心肌的ALDH2活性明顯降低。與Con組相比,ETOH組小鼠心肌的醛類的累積明顯增多。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,10-400 mmol/L酒精并沒有改變?cè)募〖?xì)胞中的ALDH2的表達(dá)量。但是高劑量酒精(100 mmol/L和400 mmol/L)明顯抑制了原代心肌細(xì)胞中ALDH2的活性。而低劑量酒精(10 mmol/L和40 mmol/L)升高了原代心肌細(xì)胞中ALDH2活性。另外,400 mmol/L酒精顯著增加原代心肌細(xì)胞中醛類的累積。3.在ACM中,ALDH2通過減少AGT和Ang Ⅱ改善酒精引起的心肌損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與ETOH組相比,ETOH+Alda-1組小鼠的LVEF增加了 15.9%。與ETOH組相比,ETOH+Alda-1組小鼠的心肌細(xì)胞肥大減輕,心肌纖維化明顯減輕。ETOH+Alda-1組小鼠心肌細(xì)胞凋亡較ETOH組降低了 28.1%。ETOH+Alda-1組小鼠心肌中的醛類也較ETOH組明顯減少。ETOH+Alda-1組小鼠心肌的AGT比ETOH組降低了 29.7%。ETOH+Alda-1組小鼠心肌的Ang Ⅱ比ETOH組降低了 46.6%。另外,與ETOH組相比,ETOH+Daidzin組小鼠心肌損傷更嚴(yán)重,醛類累積更多。與ETOH組相比,ETOH+Daidzin組小鼠心肌的AGT和Ang Ⅱ水平更高。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與ETOH組相比,ETOH+Alda-1組原代心肌細(xì)胞的AGT和AngⅡ分別降低了 27.8%和26.9%。與ETOH組相比,ETOH+Daidzin組原代心肌細(xì)胞的AGT和Ang Ⅱ分別升高了 16.6%和37.3%。與ETOH組相比,ETOH+Ad-ALDH2組原代心肌細(xì)胞的AGT和Ang Ⅱ明顯減少了 44.5%和27.5%。另外,不同濃度的Ang Ⅱ(1-1000nmol/L)并沒有改變?cè)募〖?xì)胞中ALDH2的表達(dá)量和活性。4.在ACM中,酒精通過激活心臟中p38 MAPK/CREB通路升高AGT和Ang Ⅱ動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與Con組相比,ETOH組小鼠心肌的phospho-p38 MAPK/總p38 MAPK比例升高了 1倍,phospho-CREB/總CREB比例升高了 1.4倍。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與Con組相比,ETOH組原代心肌細(xì)胞的phospho-p38 MAPK/總p38 MAPK和phospho-CREB/總CREB比例分別增加了 1.4倍。與ETOH組相比,P38 MAPK抑制劑SB203580明顯抑制酒精引起的phospho-CREB/總CREB比例的增多,達(dá)48.3%。而CREB抑制劑KG-501并沒有抑制酒精引起的phospho-p38 MAPK/總p38 MAPK比例的升高。與ETOH組相比,ETOH+SB203580組原代心肌細(xì)胞的AGT降低了 25.1%,ETOH+KG-501組原代心肌細(xì)胞的AGT降低了25.5%。與ETOH組相比,ETOH+SB203580組和ETOH+KG-501組原代心肌細(xì)胞的Ang Ⅱ都明顯減少。5.在ACM中,ALDH2抑制酒精激活的p38 MAPK/CREB通路動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與ETOH組相比,ETOH+Alda-1組小鼠心肌的phospho-p38 MAPK/總p38 MAPK比例降低了 23.6%,ETOH+Daidzin組小鼠心肌的phospho-p38 MAPK/總 p38 MAPK 比例升高了 36.3%。小鼠心肌的 phospho-CREB/總CREB比例也發(fā)現(xiàn)了類似趨勢(shì)的變化。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與ETOH組相比,ETOH+Alda-1組原代心肌細(xì)胞的phospho-p38 MAPK/總 p38 MAPK 比例降低了 29.7%,ETOH+Daidzin 組原代心肌細(xì)胞的phospho-p38 MAPK/總p38 MAPK比例升高了 27.3%。與ETOH組相比,ETOH+Alda-1組原代心肌細(xì)胞的phospho-CREB/總CREB比例降低了 28.1%,ETOH+Daidzin組原代心肌細(xì)胞的phospho-CREB/總CREB比例升高了 18.5%。與ETOH組相比,ETOH+Ad-ALDH2組原代心肌細(xì)胞的phospho-p38 MAPK/總p38 MAPK 比例和 phospho-CREB/總 CREB 比例分別降低了 28.1%和 42.6%。6.在ACM中,ALDH2通過抑制p38 MAPK/CREB通路減少AGT和Ang Ⅱ與ETOH+Alda-1組相比,ETOH+Alda-1+Anisomycin組原代心肌細(xì)胞的AGT和 Ang Ⅱ各升高了 53.8%和 96.9%。與 ETOH+Alda-1+Anisomycin 組相比,ETOH+Alda-1+Anisomycin+KG-501 組原代心肌細(xì)胞的 AGT 和 AngⅡ各降低了34.7%和49.2%。Anisomycin減弱了Alda-1降低AGT和AngⅡ的作用,而KG-501又改善了這一過程。上述結(jié)果表明在ACM中,ALDH2通過抑制p38 MAPK/CREB通路進(jìn)而降低AGT和Ang Ⅱ水平。結(jié)論1.在ACM中,ALDH2通過減少心肌局部RAS中的AGT和Ang Ⅱ改善酒精引起的心肌損傷;2.在ACM中,ALDH2通過抑制p38 MAPK/CREB通路進(jìn)而減少心肌局部RAS中的AGT和AngⅡ。研究背景急性心肌梗死(Acute myocardialinfarction,AMI)是一種全世界范圍內(nèi)患病率和致死率都很高的人類疾病。AMI病人的預(yù)后受許多危險(xiǎn)因素的影響。在這些危險(xiǎn)因素中,不管是否由糖尿病引起的高血糖都會(huì)導(dǎo)致AMI病人的預(yù)后不良。有證據(jù)表明,在心臟缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)過程中,高血糖是加劇心功能障礙,增加心肌梗死面積,加重心肌細(xì)胞凋亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。盡管有這些發(fā)現(xiàn),但高血糖加重心臟I/R損傷的機(jī)制仍有很多未知。過度的血糖升高導(dǎo)致蛋白分子的氧連接的氮乙酰葡萄糖胺(O-linked-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)修飾。O-GlcNAc 糖基化修飾是發(fā)生在蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸殘基的翻譯后修飾,由己糖胺途徑生成并分解。研究發(fā)現(xiàn)多種胞質(zhì)蛋白、核蛋白和線粒體蛋白都可以發(fā)生O-GlcNAc糖基化修飾。蛋白分子的O-GlcNAc糖基化修飾可以調(diào)節(jié)它們自身的結(jié)構(gòu)和功能,從而影響信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)和抗氧化等生物過程。然而,某些蛋白的O-GlcNAc糖基化修飾是否參與了高血糖加重心臟I/R損傷的機(jī)制仍不清楚。線粒體乙醛脫氫酶 2(Mitochondrial aldehyde dehydrogenase2,ALDH2)被發(fā)現(xiàn)是一種重要的心肌保護(hù)酶。在心臟I/R過程中,升高ALDH2活性可顯著減小心肌梗死面積,而抑制ALDH2活性后增大心肌梗死面積。在心臟I/R過程中,ALDH2對(duì)心肌的保護(hù)可能是通過對(duì)4-羥基壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)等毒性醛的解毒作用完成的。另一研究發(fā)現(xiàn),高血糖能夠抑制糖尿病大鼠心臟中ALDH2活性。盡管ALDH2分子中存在絲/蘇氨酸殘基,但在高血糖條件下ALDH2是否發(fā)生O-GlcNAc糖基化修飾導(dǎo)致自身活性降低,從而加重心臟I/R損傷,有待于進(jìn)一步研究。研究目的1.探討在高糖條件下,ALDH2是否發(fā)生了 O-GlcNAc糖基化修飾;2.探究ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾在高血糖加重心臟I/R損傷中的作用。研究方法1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組:假手術(shù)(Sham)組,生理鹽水+缺血再灌注(NS+I/R)組,急性高血糖+缺血再灌注(AHG+I/R)組,糖尿病+缺血再灌注(DM+I/R)組,DM組和DM+I/R+Alda-l組,每組10只。用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣。開胸后,結(jié)扎I/R組大鼠的前降支30 min后再灌注90 min。Sham組大鼠:靜脈注射生理鹽水(4mL/kg/h)。NS+I/R組大鼠:靜脈注射生理鹽水(4mL/kg/h)。AHG+I/R組大鼠:彈丸式注射5%葡萄糖溶液(1.5 mg/kg),后靜脈注射維持(4 mL/kg/h)。DM組大鼠:腹腔注射鏈脲佐菌素(60 mg/kg),一個(gè)月后做后續(xù)的研究。ALDH2激活劑Alda-1結(jié)扎前10 min以8mg/kg靜脈注射。在I/R過程中每10 min檢測(cè)尾靜脈血糖一次。2.心功能檢測(cè)I/R完成后,用微導(dǎo)管通過右頸動(dòng)脈插入大鼠左心室,測(cè)量左心室舒張末期壓力(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP),左心室收縮末期壓力(left ventricular end systolic pressure,LVESP)和左心室壓力上升最大速率(left ventricular maximal rate of pressure increase,+LVdp/dtmax)和左心室壓力下降最大速率(left ventricular maximal rate of pressure decrease,-LVdp/dtmax)。檢測(cè)心功能后,迅速心臟取材,置于-80℃冰箱保存或者4%多聚甲醛固定。3.TTC染色通過TTC染色檢測(cè)心臟的心肌梗死面積。4.H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)過程將H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清,1%青霉素/鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中。H9c2心肌細(xì)胞給予低糖(5mmol/L葡萄糖+25mmol/L甘露醇)或者高糖(30 mmol/L葡萄糖)處理。在葡萄糖糖濃度依賴實(shí)驗(yàn)中,葡萄糖濃度范圍是 5 mmol/L 至 35 mmol/L。H9c2心肌細(xì)胞在缺氧條件(1%02,94%N2和5%C02)下培養(yǎng)12 h后再在正常氧濃度下(95%空氣和5%CO2)培養(yǎng)2h。在H/R過程中給予ALDH2激活劑(Alda-1,10 μmol/L),O-GlcNAc 糖基化修飾抑制劑(DON,50 μmol/L)或 O-GlcNAc 糖基化修飾激活劑(PUGNAc,100μmol/L)。5.人心肌組織的獲取心肌組織來自3位糖尿病和3位非糖尿病遺體捐獻(xiàn)者的左心室。捐獻(xiàn)者不限于年齡,性別,人種的差別。糖尿病病史通過捐獻(xiàn)者的疾病史采集獲得。捐獻(xiàn)者的死因與心臟病無關(guān)。這些資料在遺體捐獻(xiàn)前由捐獻(xiàn)者家屬提供。6.組織學(xué)和形態(tài)學(xué)收集結(jié)扎點(diǎn)以下的心肌組織。4%多聚甲醛浸泡固定后用石蠟包埋心肌組織,并將心肌組織切成4 μm的薄片后進(jìn)行HE染色。7.TUNEL法凋亡染色在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,心肌組織的凋亡用組織化學(xué)方法通過凋亡試劑盒檢測(cè)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,用免疫熒光方法通過凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡。8.免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)和免疫印跡(Western blotting)分析大約500 μg的組織蛋白或細(xì)胞蛋白樣品與2-10 μg ALDH2或COX Ⅰ或NDFUA9一抗4 ℃孵育過夜,再加入20μL瓊脂糖珠子,4 ℃孵育2 h。孵育完后用裂解液清洗瓊脂糖珠子,加入1×蛋白上樣緩沖液后煮沸5min。30 μg或20μL蛋白通過10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗孵育(β-actin,O-GlcNAc,ALDH2,COXI,NDUFA9,4-HNE)、洗膜 3 次后孵育二抗、化學(xué)發(fā)光。9.ALDH2活性檢測(cè)提取出的線粒體用超聲裂解后,4 ℃以1000 ×g的轉(zhuǎn)速超速離心10 min,取上清。通過檢測(cè)ALDH2代謝NAD+生成NADH的量反映ALDH2酶活性。10.蛋白羰基檢測(cè)提取大鼠心肌組織或H9c2心肌細(xì)胞中的蛋白,檢測(cè)蛋白的羰基修飾水平。11.醛類分析心肌組織或者H9c2心肌細(xì)胞用PBS勻漿后,900 ×g離心10 min,取50 μL的上清或醛類標(biāo)準(zhǔn)品(1-1000 μmol/L)加入到黑色96孔板中,每孔中加入50μL AldeLightTM藍(lán)色反應(yīng)液,室溫下避光孵育15 min,后加入25μL的反應(yīng)緩沖液。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)Ex/Em = 365/435 nm。結(jié)果1.高血糖加重大鼠心肌I/R損傷與NS+I/R組相比,AHG+I/R組和DM+I/R組大鼠的LVEDP明顯升高,LVESP,+LVdp/dtmax和-LVdp/dtmax顯著降低,心肌梗死面積增大,心肌細(xì)胞凋亡增多。2.在心臟I/R出現(xiàn)高血糖過程中,大鼠心臟中的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾增多與Sham組相比,I/R過程沒有增加大鼠心肌總蛋白的O-GlcNAc糖基化修飾。然而,與NS+I/R組相比,AHG+I/R組和DM+I/R組大鼠心肌總蛋白的O-GlcNAc糖基化修飾明顯增多。與Sham組相比,NS+I/R組大鼠心肌中的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾略有增多,且沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與NS+I/R組相比,AHG+I/R組和DM+I/R組大鼠心肌ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾各增多了 2.29倍和2.67倍。與Sham組相比,NS+I/R組、AHG+I/R組和DM+I/R組大鼠心臟ALDH2表達(dá)沒有明顯的差異。與Sham組相比,NS+I/R組大鼠心肌中ALDH2活性沒有顯著變化。與NS+I/R組相比,AHG+I/R組大鼠心肌ALDH2活性降低了 17.2%,DM+I/R組大鼠心肌ALDH2活性降低了 19.2%。3.高糖增加ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾在遺體捐獻(xiàn)者的心臟中,糖尿病組的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾較非糖尿病組明顯升高28.3%。在糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠心臟中也發(fā)現(xiàn)了相似的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾的變化趨勢(shì)。高糖處理H9c2心肌細(xì)胞48 h引起ALDH2 O-糖基化修飾增加60.8%。隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的升高(5-35 mmol/L),H9c2心肌細(xì)胞的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾逐漸增高,30 mmol/L和35 mmol/L高糖培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞的ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在遺體捐獻(xiàn)者的心臟中,糖尿病組的ALDH2活性較非糖尿病組降低了15.9%。與非糖尿病大鼠比較,糖尿病大鼠心臟ALDH2活性降低了 19.6%。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,隨著葡萄糖濃度的升高,ALDH2活性有降低的趨勢(shì)。在30mmol/L和35 mmol/L時(shí),ALDH2活性顯著降低。4.ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾影響ALDH2活性細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,與Con組相比,PUGNAc組ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾增加62.9%,DON組ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾減少44.1%。與Con組相比,PUGNAc組ALDH2活性降低18.1%,DON組ALDH2活性升高17.9%。與Con組相比,HG+PUGNAc組ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾增加了 1.16倍,高糖單獨(dú)增加ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾比例達(dá)66.2%。這意味著在高糖條件下,PUGNAc仍然能增加ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾。HG+DON組ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾降到了基礎(chǔ)水平。與Con組比較,ALDH2活性在高糖條件下明顯降低。與HG組相比,HG+PUGNAc組ALDH2活性明顯降低,而HG+DON組ALDH2活性恢復(fù)到正常水平。我們進(jìn)一步明確了在H/R條件下,PUGNAc和DON能否調(diào)控ALDH2活性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為 Con+H/R 組,Con+PUGNAc+H/R 組,Con+DON+H/R 組,HG+H/R組,HG+PUGNAc+H/R 組,HG+DON+H/R 組。ALDH2 O-GlcNAc 糖基化修飾和ALDH2活性的變化趨勢(shì)與非H/R處理的6個(gè)組的趨勢(shì)是一致的。5.ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾導(dǎo)致4-HNE、醛和蛋白羰基修飾增多,心肌細(xì)胞凋亡加重在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,與Sham組相比,NS+I/R組的4-HNE稍有增多,AHG+I/R組和DM+I/R組的4-HNE明顯增多。醛類累積和蛋白羰基修飾的變化趨勢(shì)與4-HNE一致。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,與Con組相比,HG組的4-HNE明顯增多。HG+H/R組的4-HNE較HG組明顯增多。與HG組和HG+H/R組相比,HG+H/R+DON組的4-HNE顯著降低。醛類累積和蛋白羰基修飾的變化趨勢(shì)與4-HNE 一致。與Con組相比,HG組與HG+H/R組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)升高。與HG組和HG+H/R組相比,HG+H/R+DON組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低。6.Alda-1降低ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾并改善了心肌I/R損傷我們檢測(cè)了 Con組、HG組、HG+H/R組和HG+H/R+Alda-1組H9c2心肌細(xì)胞的ALDH2活性。與Con組比較,HG組和HG+H/R組的ALDH2活性明顯降低。與HG組和HG+H/R組比較,HG+H/R+Alda-1組的ALDH2活性明顯升高。與 HG 組和 HG+H/R 組相比,HG+H/R+Alda-1 組 ALDH2 O-GlcNAc 糖基化修飾明顯降低。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,與DM組和DM+I/R組相比,DM+I/R+Alda-1組大鼠心肌中ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾顯著降低。與DM+I/R組相比,DM+I/R+Alda-1組大鼠的LVEDP明顯降低,LVESP、+LVdp/dtmax和-LVdp/dtmax明顯升高,心肌梗死面積顯著減小,心肌細(xì)胞凋亡顯著改善。結(jié)論1.高糖引起ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾增多;2.ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾增多導(dǎo)致ALDH2活性降低,并加重心臟I/R損傷;3.Alda-l抑制了 ALDH2 O-GlcNAc糖基化修飾,改善了高糖加重的心臟I/R損傷。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R542.2
【部分圖文】：

圖１．大量酒精攝入引起心功能降低、心肌肥厚、心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡。逡逑（Ａ）邋ＬＶＥＦ。（Ｂ）邋ＷＧＡ染色檢測(cè)心肌橫截面積（標(biāo)尺，２０0ｎｍ）。（Ｃ和Ｄ）馬逡逑松染色和天狼星紅染色分別檢測(cè)心肌纖維化水平（標(biāo)尺，２００（ｉｍ）。（Ｅ）邋ＴＵＮＥＬ逡逑法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平（標(biāo)尺，１００邋ＨｍＸＣｏｎ，對(duì)照組；ＥＴＯＨ，酒精組。＊Ｐ＜０．０５逡逑ｖｓ．邋Ｃｏｎ組。全部數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤（Ｍｅａｎ士ＳＥＭ）表示（ｎ＝３－５）。逡逑３８逡逑

圖２．大量酒精攝入引起心臟中的ＡＧＴ和Ａｎｇ邋ＩＩ升高。（Ａ）心肌組織中ＡＧＴ的逡逑表達(dá)量。（Ｂ）心肌組織中Ａｎｇ邋ＩＩ的表達(dá)量。（Ｃ）原代心肌細(xì)胞中ＡＧＴ的表達(dá)量。逡逑（Ｄ）原代心肌細(xì)胞中Ａｎｇ邋ＩＩ的表達(dá)量。Ｃｏｎ，對(duì)照組；ＥＴＯＨ，酒精組。＊Ｐ＜０．０５逡逑ｖｓ．邋Ｃｏｎ組。全部數(shù)據(jù)均采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤（Ｍｅａｎ土ＳＥＭ）表不（ｎ＝３－５）。逡逑３９逡逑

圖３．在ＡＣＭ中，心肌的ＡＬＤＨ２活性受到抑制。（Ａ）心肌組織中ＡＬＤＨ２的表逡逑達(dá)量。（Ｂ）心肌組織中ＡＬＤＨ２的活性。（Ｃ）原代心肌細(xì)胞中ＡＬＤＨ２表達(dá)量。逡逑（Ｄ）原代心肌細(xì)胞中ＡＬＤＨ２活性。（Ｅ）心肌組織中醛類累積。（Ｆ）原代心肌逡逑細(xì)胞中醛類累積。Ｃｏｎ，對(duì)照組；ＥＴＯＨ，酒精組。＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．Ｃｏｎ組。全部數(shù)逡逑４０逡逑

本文編號(hào)：2814554