【摘要】：目的:脂肪組織是一個活躍的內分泌器官,釋放多種具有生物活性的脂肪因子,這些脂肪因子作用于免疫細胞,引起局部和全身炎癥反應,直接或間接影響內皮功能和血管健康。內脂素,也稱為前B細胞克隆增強因子,是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肪因子,主要由內臟脂肪組織產(chǎn)生,具有類胰島素活性,與肥胖及肥胖相關性疾病有關。內脂素也是一種新的促炎癥細胞因子,劑量依賴性上調人單核細胞IL-1β、IL-6和TNF-α表達,各種炎癥性疾病血漿內脂素水平增高。此外,內脂素還是一種新的血管炎癥介質,可提高THP-1單核細胞MMP-9活性和外周血單核細胞TNF-α和IL-8水平,誘導內皮細胞分泌ICAM-1和VCAM-1,增強內皮細胞MMP-2和-9的活性。在動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的過程中內脂素可能起了一定的作用,有癥狀患者的頸動脈斑塊較無癥狀患者的頸動脈斑塊的內脂素基因表達顯著增強;冠心病患者,特別是急性冠脈綜合征患者血漿內脂素水平顯著增高。內脂素定位于不穩(wěn)定斑塊富含脂質的泡沫巨噬細胞,可能在斑塊不穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要作用。ET-1是內皮細胞分泌的迄今已知的作用最強的血管收縮肽,能夠收縮血管,促進炎癥反應,促有絲分裂和增殖,刺激自由基生成和激活血小板。內皮素(ET)-1與高血壓、高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、糖尿病和冠心病等多種心血管疾病的內皮功能障礙有關。血管內皮損傷刺激ET-1表達,觸發(fā)內皮黏附、血管平滑肌細胞增殖,最終導致動脈粥樣硬化形成。而內皮功能障礙是動脈粥樣硬化和血管疾病發(fā)病的初期階段,是心血管事件的獨立預測因子。經(jīng)典觀點認為,內皮來源的舒張因子NO、前列環(huán)素和內皮依賴性超極化因子的生物利用度降低,引起血管舒張功能受損,導致內皮功能障礙。目前觀點認為,ET-1的產(chǎn)生增加和生物活性增強可導致內皮功能障礙。ET-1可能通過降低NO的生物利用度,導致內皮功能障礙。臨床研究顯示血漿內脂素水平與內皮功能受損相關,2型糖尿病患者血漿內脂素水平與血流介導的血管舒張功能呈顯著負相關,發(fā)現(xiàn)內脂素可能損害血管內皮功能,但是作用機制未明。盡管最近有研究提出內脂素很可能通過激活NF-κB通路,增加內皮細胞炎癥因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1、VCAM-1以及E-選擇素基因的表達,引起血管內皮功能障礙,然而內脂素能否誘導血管內皮細胞表達ET-1基因,進而損害內皮功能尚不清楚。本研究旨在觀察人重組內脂素對人臍靜脈內皮細胞ET-1基因表達的影響,探討內脂素誘導內皮細胞表達ET-1基因的信號轉導機制,為內脂素損害內皮功能、促進AS提供新的依據(jù)。研究方法:1、細胞培養(yǎng):不同濃度內脂素與HUVECs孵育不同時間,收集細胞和細胞培養(yǎng)上清液�？寡趸瘎㎞AC、MEK抑制劑U0126與HUVECs預孵育,再加入500ng/ml濃度的內脂素孵育,收集標本用于指標檢測。2、采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清液ET-1蛋白濃度。3、采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測內皮細胞ET-1 mRNA的表達水平。4、利用激光共聚焦顯微鏡進行細胞內ROS檢測。5、采用Western blot方法檢測內皮細胞細胞外信號調節(jié)激酶ERK和磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶p-ERK的活性。6、采用非放射性電泳遷移實驗(EMSA)檢測核轉錄因子AP-1的活性。結果:1、內脂素與HUVECs孵育0、6h、12h和24h,隨著孵育時間延長,內皮細胞ET-1蛋白分泌增加,24h時ET-1蛋白濃度最高(42.77±3.80 vs 0.67±0.03,P0.001)。不同濃度內脂素0、50、150、500、1500ng/ml與HUVECs孵育24h,隨著內脂素濃度增加,內皮細胞ET-1蛋白分泌增加(19.36±2.56 vs 26.82±1.93,32.58±3.77,42.77±4.16,51.77±4.48,P0.01)。內脂素劑量依賴性上調內皮細胞ET-1蛋白分泌。2、內脂素與HUVECs孵育0、4h、6h和12h,4h內皮細胞ET-1 mRNA水平開始增高(P0.05),6h達到高峰(P0.05),隨后下降。不同濃度內脂素0、50、150、500、1500ng/ml與HUVECs孵育6h,隨著內脂素濃度增加,內皮細胞ET-1 mRNA表達水平增加(P0.05)。內脂素劑量依賴性上調內皮細胞ET-1 mRNA表達。3、內脂素與HUVECs孵育30min,內皮細胞內ROS水平顯著增高(106.51±26.52 vs 27.94±4.18,P0.05)�？寡趸瘎㎞AC預處理內皮細胞,顯著抑制內脂素誘導的細胞內ROS增高(43.47±5.22 vs 106.51±26.52,P0.05)。4、內脂素與HUVECs孵育6h,內皮細胞ET-1mRNA表達明顯增加(P0.01);NAC預處理內皮細胞,顯著抑制內脂素誘導的ET-1mRNA表達(P0.01)。同樣,內脂素與HUVECs孵育24h,顯著增加內皮細胞ET-1蛋白分泌(40.12±4.72 vs 18.28±2.45,P0.01);NAC預處理內皮細胞,顯著抑制內脂素誘導的ET-1蛋白分泌(20.54±2.67 vs 40.12±4.72,P0.01)。5、內脂素與HUVECs孵育0、10min、15min、20min和30min,內脂素誘導ERK p42和p44磷酸化,10min磷酸化反應顯著增加,15min達到高峰,隨后下降。內脂素與HUVECs孵育15min,內脂素顯著增加內皮細胞p-ERK1/2活性;NAC和U0126預處理內皮細胞,顯著抑制內脂素誘導的p-ERK1/2活性增加,并抑制內脂素誘導的ET-1 mRNA表達和蛋白分泌。6、內脂素與HUVECs孵育1h,核轉錄因子AP-1活性增加;NAC和U0126預處理內皮細胞,抑制內脂素誘導的AP-1活性增加。結論:1、內脂素在體外能夠劑量依賴性上調HUVECs ET-1基因表達。內脂素很可能通過激活內皮細胞高表達ET-1導致內皮功能障礙。2、內脂素誘導HUVECs產(chǎn)生ROS,抗氧化劑NAC抑制內脂素誘導的ROS增加,并抑制內脂素誘導的ET-1mRNA表達和蛋白分泌。ROS在內脂素誘導的ET-1基因表達中發(fā)揮重要作用。3、內脂素激活內皮細胞ERK1/2通路,NAC和U0126可阻斷內脂素誘導的ERK1/2通路激活,同時抑制內脂素誘導的ET-1 mRNA表達和蛋白分泌。內脂素激活的ERK通路是氧化還原敏感的信號通路,是內脂素誘導ET-1基因表達的關鍵環(huán)節(jié)。4、內脂素增加內皮細胞核轉錄因子AP-1活性,NAC和U0126可抑制內脂素誘導的AP-1活性增加。AP-1結合序列是內脂素誘導的ET-1基因表達的重要順式作用元件,氧化還原敏感的AP-1在內脂素誘導ET-1基因表達中起重要作用。ROS通過ROS依賴機制介導AP-1激活,ERK通路參與內脂素誘導的AP-1激活。5、內脂素至少部分通過ROS-ERK介導的AP-1依賴通路上調ET-1基因表達。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R54

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本文編號：2806654