【摘要】：目的:脂肪組織是一個(gè)活躍的內(nèi)分泌器官,釋放多種具有生物活性的脂肪因子,這些脂肪因子作用于免疫細(xì)胞,引起局部和全身炎癥反應(yīng),直接或間接影響內(nèi)皮功能和血管健康。內(nèi)脂素,也稱為前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子,是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肪因子,主要由內(nèi)臟脂肪組織產(chǎn)生,具有類胰島素活性,與肥胖及肥胖相關(guān)性疾病有關(guān)。內(nèi)脂素也是一種新的促炎癥細(xì)胞因子,劑量依賴性上調(diào)人單核細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá),各種炎癥性疾病血漿內(nèi)脂素水平增高。此外,內(nèi)脂素還是一種新的血管炎癥介質(zhì),可提高THP-1單核細(xì)胞MMP-9活性和外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-8水平,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌ICAM-1和VCAM-1,增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2和-9的活性。在動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的過程中內(nèi)脂素可能起了一定的作用,有癥狀患者的頸動(dòng)脈斑塊較無癥狀患者的頸動(dòng)脈斑塊的內(nèi)脂素基因表達(dá)顯著增強(qiáng);冠心病患者,特別是急性冠脈綜合征患者血漿內(nèi)脂素水平顯著增高。內(nèi)脂素定位于不穩(wěn)定斑塊富含脂質(zhì)的泡沫巨噬細(xì)胞,可能在斑塊不穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要作用。ET-1是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的迄今已知的作用最強(qiáng)的血管收縮肽,能夠收縮血管,促進(jìn)炎癥反應(yīng),促有絲分裂和增殖,刺激自由基生成和激活血小板。內(nèi)皮素(ET)-1與高血壓、高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和冠心病等多種心血管疾病的內(nèi)皮功能障礙有關(guān)。血管內(nèi)皮損傷刺激ET-1表達(dá),觸發(fā)內(nèi)皮黏附、血管平滑肌細(xì)胞增殖,最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成。而內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化和血管疾病發(fā)病的初期階段,是心血管事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。經(jīng)典觀點(diǎn)認(rèn)為,內(nèi)皮來源的舒張因子NO、前列環(huán)素和內(nèi)皮依賴性超極化因子的生物利用度降低,引起血管舒張功能受損,導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。目前觀點(diǎn)認(rèn)為,ET-1的產(chǎn)生增加和生物活性增強(qiáng)可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。ET-1可能通過降低NO的生物利用度,導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。臨床研究顯示血漿內(nèi)脂素水平與內(nèi)皮功能受損相關(guān),2型糖尿病患者血漿內(nèi)脂素水平與血流介導(dǎo)的血管舒張功能呈顯著負(fù)相關(guān),發(fā)現(xiàn)內(nèi)脂素可能損害血管內(nèi)皮功能,但是作用機(jī)制未明。盡管最近有研究提出內(nèi)脂素很可能通過激活NF-κB通路,增加內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1、VCAM-1以及E-選擇素基因的表達(dá),引起血管內(nèi)皮功能障礙,然而內(nèi)脂素能否誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ET-1基因,進(jìn)而損害內(nèi)皮功能尚不清楚。本研究旨在觀察人重組內(nèi)脂素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ET-1基因表達(dá)的影響,探討內(nèi)脂素誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ET-1基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,為內(nèi)脂素?fù)p害內(nèi)皮功能、促進(jìn)AS提供新的依據(jù)。研究方法:1、細(xì)胞培養(yǎng):不同濃度內(nèi)脂素與HUVECs孵育不同時(shí)間,收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。抗氧化劑NAC、MEK抑制劑U0126與HUVECs預(yù)孵育,再加入500ng/ml濃度的內(nèi)脂素孵育,收集標(biāo)本用于指標(biāo)檢測(cè)。2、采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液ET-1蛋白濃度。3、采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA的表達(dá)水平。4、利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)。5、采用Western blot方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶p-ERK的活性。6、采用非放射性電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性。結(jié)果:1、內(nèi)脂素與HUVECs孵育0、6h、12h和24h,隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng),內(nèi)皮細(xì)胞ET-1蛋白分泌增加,24h時(shí)ET-1蛋白濃度最高(42.77±3.80 vs 0.67±0.03,P0.001)。不同濃度內(nèi)脂素0、50、150、500、1500ng/ml與HUVECs孵育24h,隨著內(nèi)脂素濃度增加,內(nèi)皮細(xì)胞ET-1蛋白分泌增加(19.36±2.56 vs 26.82±1.93,32.58±3.77,42.77±4.16,51.77±4.48,P0.01)。內(nèi)脂素劑量依賴性上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1蛋白分泌。2、內(nèi)脂素與HUVECs孵育0、4h、6h和12h,4h內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA水平開始增高(P0.05),6h達(dá)到高峰(P0.05),隨后下降。不同濃度內(nèi)脂素0、50、150、500、1500ng/ml與HUVECs孵育6h,隨著內(nèi)脂素濃度增加,內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)水平增加(P0.05)。內(nèi)脂素劑量依賴性上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)。3、內(nèi)脂素與HUVECs孵育30min,內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增高(106.51±26.52 vs 27.94±4.18,P0.05)。抗氧化劑NAC預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞,顯著抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS增高(43.47±5.22 vs 106.51±26.52,P0.05)。4、內(nèi)脂素與HUVECs孵育6h,內(nèi)皮細(xì)胞ET-1mRNA表達(dá)明顯增加(P0.01);NAC預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞,顯著抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的ET-1mRNA表達(dá)(P0.01)。同樣,內(nèi)脂素與HUVECs孵育24h,顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞ET-1蛋白分泌(40.12±4.72 vs 18.28±2.45,P0.01);NAC預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞,顯著抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的ET-1蛋白分泌(20.54±2.67 vs 40.12±4.72,P0.01)。5、內(nèi)脂素與HUVECs孵育0、10min、15min、20min和30min,內(nèi)脂素誘導(dǎo)ERK p42和p44磷酸化,10min磷酸化反應(yīng)顯著增加,15min達(dá)到高峰,隨后下降。內(nèi)脂素與HUVECs孵育15min,內(nèi)脂素顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞p-ERK1/2活性;NAC和U0126預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞,顯著抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的p-ERK1/2活性增加,并抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的ET-1 mRNA表達(dá)和蛋白分泌。6、內(nèi)脂素與HUVECs孵育1h,核轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性增加;NAC和U0126預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞,抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的AP-1活性增加。結(jié)論:1、內(nèi)脂素在體外能夠劑量依賴性上調(diào)HUVECs ET-1基因表達(dá)。內(nèi)脂素很可能通過激活內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)ET-1導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。2、內(nèi)脂素誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS,抗氧化劑NAC抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的ROS增加,并抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的ET-1mRNA表達(dá)和蛋白分泌。ROS在內(nèi)脂素誘導(dǎo)的ET-1基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。3、內(nèi)脂素激活內(nèi)皮細(xì)胞ERK1/2通路,NAC和U0126可阻斷內(nèi)脂素誘導(dǎo)的ERK1/2通路激活,同時(shí)抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的ET-1 mRNA表達(dá)和蛋白分泌。內(nèi)脂素激活的ERK通路是氧化還原敏感的信號(hào)通路,是內(nèi)脂素誘導(dǎo)ET-1基因表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。4、內(nèi)脂素增加內(nèi)皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性,NAC和U0126可抑制內(nèi)脂素誘導(dǎo)的AP-1活性增加。AP-1結(jié)合序列是內(nèi)脂素誘導(dǎo)的ET-1基因表達(dá)的重要順式作用元件,氧化還原敏感的AP-1在內(nèi)脂素誘導(dǎo)ET-1基因表達(dá)中起重要作用。ROS通過ROS依賴機(jī)制介導(dǎo)AP-1激活,ERK通路參與內(nèi)脂素誘導(dǎo)的AP-1激活。5、內(nèi)脂素至少部分通過ROS-ERK介導(dǎo)的AP-1依賴通路上調(diào)ET-1基因表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2806654