【摘要】：一、背景與目的自噬是一種維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要的代謝過程,通過溶酶體降解長壽命蛋白及無功能的細胞器,從而為細胞代謝提供原料,進而促進細胞的存活。在自噬的發(fā)生過程中,微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的前體在ATG4的作用下轉化為LC3-I,然后再與磷脂酰乙醇胺結合從而形成LC3-II。在哺乳動物中,LC3-I向LC3-II的轉化是自噬體形成的關鍵步驟,從而被作為最常用的檢測自噬的方法之一。微小核糖核酸(micro RNA,mi RNA,mi R-)是一種內源性的非編碼的核糖核酸分子,能夠在轉錄后水平調節(jié)基因的表達。正因為此,micro RNA能夠對多數(shù)生物學進程起到調控作用,包括增殖、分化、凋亡和自噬等,從而也與包括心血管疾病在內的很多疾病的發(fā)生了關聯(lián)。Mi RNA在心臟中的作用最早是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的。其后研究者又發(fā)現(xiàn)了mi R-208a、mi R-1和mi R-133等在心肌肥厚中的作用�，F(xiàn)在越來越多的研究揭示了mi RNA在心肌梗死的病理生理過程中的重要作用。近年來mi RNA和自噬的關系正越來越受到關注。隨著首次報道m(xù)i R-30a靶向BECN1調控自噬之后,人們發(fā)現(xiàn)了很多通過自噬核心通路起作用的mi RNA。在心肌細胞中Xiao等率先發(fā)現(xiàn)了mi RNA調控自噬中的作用。其他研究還發(fā)現(xiàn)mi R-30a能夠靶向Beclin1調節(jié)心肌細胞自噬,mi R-325能靶向ARC增強缺血/再灌注損傷下的心肌細胞自噬等等。Mi R-199a主要在心肌細胞中表達,并且已被發(fā)現(xiàn)與多種心血管疾病有關。我們在之前報道的研究中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mi R-199a能夠調控心肌肥厚,但mi R-199a與自噬在心血管系統(tǒng)中的關系尚不清楚。我們設計本研究旨在探討mi R-199a在心肌細胞自噬中的表達情況及其調控作用。我們通過將離體心肌細胞置于無血清的饑餓環(huán)境下,誘導心肌細胞發(fā)生自噬,檢測mi R-199a的表達情況,并進一步對心肌細胞敲低和過表達mi R-199a來探討自噬活性的變化。我們還進一步探討了mi R-199a調控饑餓誘導的心肌細胞自噬的潛在的靶基因。二、研究方法(一)乳大鼠心肌細胞分離和培養(yǎng)原代心肌細胞取自新生2天的SD大鼠。75%酒精消毒乳鼠,于無菌環(huán)境下取出心臟,置于D-Hanks液中,去除心房保留心室,以眼科剪將心肌組織分成約1mm3大小組織塊,并洗凈殘留的血液。以膠原酶消化后離心去除上清,并采用梯度貼壁法去除成纖維細胞等其他心臟細胞,保留懸浮細胞即為心肌細胞。計數(shù),接種于12孔或24孔板中以備使用。細胞培養(yǎng)條件為完全DMEM培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清+1%青鏈霉素)。以平衡鹽溶液EBSS替代完全DMEM培養(yǎng)基以營造無血清的饑餓環(huán)境,一定時間后收取細胞供下一步檢測使用。(二)實時定量聚合酶鏈反應檢測(q RT-PCR)以Trizol常規(guī)方法抽提乳大鼠心肌細胞的RNA,使用特定的引物進行反轉錄。實時定量PCR按照SYBR Green Mix的標準步驟執(zhí)行,采用Rotor-Gene RG-3000A機器進行檢測分析。選取U6作為參照物并計算ΔCt值。采用2-ΔΔCt法計算目標核糖核酸的表達水平。引物序列如下所示(5’端至3’端,以下均為大鼠):mi R-199a-3p Forward,CTGAGTACAGTAGTCTGCACAT;mi R-199a-5p Forward,CTGAGTCCCAGTGTTCAGACT;mi RNAs common Reverse,GTGCAGGGTCCGAGGT;Twist1 Forward,CACGCTGCCCTCGGACAA;Twist1 Reverse,GGGACGCGGACATGGACC;U6Forward,CTCGCTTCGGCAGCACA,U6 Reserve,AACGCTTCACGAATTTGCGT。(三)腺病毒構建及細胞轉染重組腺病毒的構建、擴增及滴度測定方法按照Graham等提出的經(jīng)典方法實施。所有DNA均通過腺病毒轉染入心肌細胞中。mi R-199a-3p和mi R-199a-5p抑制劑(inhibitor)則通過Lipofectamine LTX轉染進心肌細胞。秀麗隱桿線蟲的mi RNA inhibitor按照同樣的方法設計,并作為陰性對照(NC)。采用q RT-PCR檢測轉染效率。(四)蛋白免疫印跡檢測(Western blot)采用蛋白免疫印跡檢測心肌細胞中LC3-I、LC3-II、HSPA5和GAPDH的水平。心肌細胞經(jīng)饑餓處理后,使用SDS-PAGE Loading Buffer提取蛋白。根據(jù)目標蛋白的分子量采用10%或15%的分離膠。常規(guī)80-120V電泳,100V、2 h濕轉法轉膜。5%脫脂牛奶封閉后,孵育一抗4℃過夜。TBST洗滌3次后,室溫下避光孵育二抗1 h。采用Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)檢測分析蛋白條帶。一抗?jié)舛确謩e為:anti-LC3(1:500)、anti-GAPDH(1:1000)、anti-HSPA5(1:1000)。二抗?jié)舛?anti-mouse(1:5000),anti-rabbit(1:10000)。(五)細胞免疫熒光檢測心肌細胞接種于24孔培養(yǎng)板后,如前所述使用EBSS饑餓處理4h。隨后用4%多聚甲醛/PBS室溫下固定10 min,1:1000的Triton X-100/PBS作可滲透化處理,5%山羊血清封閉30 min,與anti-LC3抗體(1:200)室溫下孵育1 h,PBS洗滌3次后,加入結合Alexa Fluor 594的二抗(1:200)孵育30 min,之后以DAPI染核。甘油封片,放置于Leica TCS SP5激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。鏡下觀察到的LC3紅色熒光小點視為細胞內的自噬體和自噬溶酶體。(六)透射電子顯微鏡觀察心肌細胞經(jīng)饑餓處理后使用多聚甲醛固定后送檢。東芝H7650型透射電子顯微鏡檢測方法按照標準方法操作。透射電鏡下觀察到雙層膜結構囊泡狀的自噬體作為自噬定性和定量檢測的“金標準”之一。(七)雙熒光素酶報告基因融合了Hspa5 m RNA 3’UTR的熒光素酶質粒和mi R-199a類似物被共轉染至293T細胞中。轉染24 h后裂解細胞。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光酶活性。螢火蟲熒光素的活性使用海腎熒光素活性進行標準化,并對結果進行分析。(八)統(tǒng)計學分析計量資料以平均數(shù)±標準差表示,每組實驗數(shù)據(jù)至少重復3次。兩組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗。以P0.05作為顯著性差異標準。三、結果(一)饑餓誘導心肌細胞自噬使用EBSS饑餓4 h后心肌細胞顯著發(fā)生自噬。Western blot示饑餓組LC3-II/I的比值較對照組顯著升高。免疫熒光檢測觀察到心肌細胞內的LC3紅色熒光小點在饑餓組多于對照組。我們采用透射電子顯微鏡同樣觀察到了在饑餓條件下心肌細胞內雙層膜結構自噬體的形成,而在對照組未能觀察到這一現(xiàn)象。上述結果均證實在饑餓4 h后心肌細胞的自噬被顯著激活。(二)Twist1和mi R-199a的表達變化由于mi R-199a已被證實與很多心血管疾病有關,因此我們檢測了饑餓4 h后心肌細胞中mi R-199a的表達情況。q RT-PCR結果示在饑餓4 h后,心肌細胞中mi R-199a-3p和mi R-199a-5p的表達量均顯著降低。為了進一步分析mi R-199a表達降低的機制,我們檢測了轉錄因子Twist1的表達水平。結果顯示Twist1在饑餓組的表達同樣受到了抑制。由于Twist1作為轉錄因子,能夠調控編碼mi R-199a的RNA的表達,因此可以認為在饑餓4 h時,Twist1的表達下降進一步導致了mi R-199a的下調,同時二者都可能與饑餓誘導的心肌細胞自噬有關。(三)過表達mi R-199a抑制饑餓誘導的心肌細胞自噬我們采用過表達mi R-199a的方法來探討其在饑餓誘導的心肌細胞自噬中的作用。我們首先用mi R-199a過表達腺病毒轉染心肌細胞,轉染48 h后驗證mi R-199a的表達確定轉染效率,q RT-PCR結果顯示mi R-199a-3p和mi R-199a-5p的表達量均較GFP對照組顯著升高12-20倍,提示轉染有效。繼續(xù)用EBSS誘導自噬,Western blot檢測結果顯示mi R-199a過表達后LC3-II/I的比值顯著下降約52%,免疫熒光也觀察到mi R-199a過表達后心肌細胞內紅色LC3小點的數(shù)量較對照組要少。上述結果提示過表達mi R-199a抑制了饑餓誘導的心肌細胞自噬。(四)抑制mi R-199a促進饑餓誘導的心肌細胞自噬使用mi R-199a-3p抑制物(inhibitor)和mi R-199a-5p inhibitor分別處理心肌細胞。Western blot顯示抑制mi R-199a-3p和mi R-199a-5p的表達均能顯著升高LC3-II/I的比值,且以抑制mi R-199a-5p的作用更為顯著。免疫熒光檢測同樣發(fā)現(xiàn),在抑制mi R-199a-3p和mi R-199a-5p后心肌細胞內的紅色LC3小點均較對照組增多,且在mi R-199a-5p組效果更明顯。因此上述結果進一步提示下調mi R-199a-3p或mi R-199a-5p的表達水平均能夠促進饑餓誘導的心肌細胞自噬活性,而mi R-199a-5p在其中的作用可能更加顯著和重要。(五)mi R-199a直接抑制HSPA5表達我們采用生物信息學檢索預測mi R-199a可能的靶基因,從而進一步探討mi R-199a調控心肌細胞自噬的潛在機制。采用mi RBase和Target Scan軟件篩選發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白5基因(Hspa5)是mi R-199a的潛在的靶基因。Hspa5編碼HSPA5蛋白,又稱GRP78,是內質網(wǎng)應激相關標志物,在內質網(wǎng)應激誘導的自噬中起到重要作用。通過生物信息學檢索,我們發(fā)現(xiàn)Hspa5的3’UTR含有mi R-199a-5p的可能的結合位點,因此我們采用熒光素酶報告基因驗證Hspa5是否是mi R-199a的靶基因。結果顯示過表達mi R-199a顯著抑制了融合有Hspa5-3’-UTR的熒光素酶表達,表明Hspa5是mi R-199a的直接靶基因。Western blot也進一步驗證了在過表達mi R-199a后HSPA5蛋白的表達顯著受到抑制,而敲低mi R-199a-3p和mi R-199a-5p后都能促進HSPA5蛋白的表達,尤其在敲低mi R-199a-5p后作用更明顯。上述結果均提示mi R-199a可能通過靶向Hspa5對心肌細胞自噬起調控作用。四、結論(一)以EBSS平衡鹽溶液體外處理心肌細胞營造饑餓環(huán)境能夠誘導離體的乳大鼠心肌細胞發(fā)生自噬,在饑餓4 h后自噬活性被顯著激活。(二)在饑餓誘導的自噬時,心肌細胞中mi R-199a的表達顯著下降,這可能是通過轉錄因子Twist1的下調實現(xiàn)的。(三)過表達mi R-199a能顯著抑制饑餓誘導的心肌細胞自噬,而敲低mi R-199a-3p和mi R-199a-5p后則能促進自噬的激活,而且以mi R-199a-5p的作用更顯著。(四)mi R-199a靶向作用于Hspa5并直接抑制HSPA5的表達,并可能通過這條途徑抑制了饑餓誘導的心肌細胞自噬。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R54


本文編號：2800315