【摘要】：實(shí)驗(yàn)背景冠狀動脈性心臟病(coronary artery heart disease,CHD)簡稱冠心病,是一種由冠狀動脈狹窄、供血不足而引起的心肌機(jī)能障礙和(或)器質(zhì)性病變的常見心臟疾病,已成為造成人類死亡的第一大疾病。目前,冠心病的治療主要有三種方式:藥物治療、外科手術(shù)治療和介入治療。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療是目前治療冠狀動脈嚴(yán)重狹窄最主要的手段,被廣泛的應(yīng)用于臨床。但是由于支架植入時機(jī)械性擴(kuò)張冠狀動脈,造成血管壁深層損傷,從而引起炎癥反應(yīng)和血管平滑肌細(xì)胞過度增生導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生和血栓形成,所以支架植入人體后3-6個月仍存在13%-18%的再狹窄發(fā)生。因此支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis,ISR)機(jī)制的研究是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,具有重大的理論和現(xiàn)實(shí)意義。大量的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)醫(yī)用金屬材料長期植入人體內(nèi)會發(fā)生腐蝕或磨蝕現(xiàn)象,這會造成金屬離子溶出而影響到人體組織的新陳代謝,而支架中溶出的鎳(Ni)離子就是一種眾所周知的有害元素。鎳離子可引起細(xì)胞毒性作用,激活炎癥過程,增加炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,包括白細(xì)胞介素(IL-1b)、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子(TNF)。另一方面,金屬支架能持續(xù)釋放鎳離子,導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)過度增殖,這與ISR有關(guān)。有研究表明鎳離子誘導(dǎo)再狹窄的原因與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有關(guān)。因此,研發(fā)一種新型可降低ISR發(fā)生的低鎳冠脈金屬支架平臺是冠脈支架的一個改進(jìn)方向。本研究進(jìn)行了6個月的在體動物實(shí)驗(yàn)觀察包括評估低鎳高氮不銹鋼(HNS)支架對內(nèi)皮化及內(nèi)膜增生的影響,同時體外實(shí)驗(yàn)包括評估人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvecs)的增殖情況和血管內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng),研究低鎳高氮不銹鋼材料對新生內(nèi)膜增生的作用機(jī)制。本研究希望能為低鎳高氮不銹鋼支架的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)采用低鎳高氮不銹鋼金屬支架(high nitrogen low nickel stainless or high nitrogen nickel-free stainless steel,HNS),應(yīng)用血液相容性和細(xì)胞相容性來評價這種新型支架的體外安全性;而后通過在體動物實(shí)驗(yàn),經(jīng)組織學(xué)及影像學(xué)方法觀察該支架植入健康家豬冠脈后28天和6個月的支架內(nèi)膜增生的情況,并探討其應(yīng)用在臨床的可行性;最后通過分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法觀察新型HNS支架材料對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響并研究了可能的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法1.血液相容性檢測:以316L不銹鋼支架材料為對照組,通過溶血實(shí)驗(yàn)、蛋白吸附實(shí)驗(yàn)、血小板吸附實(shí)驗(yàn)評價新型低鎳高氮不銹鋼支架的體外血液相容性。2.組織相容性評價:將HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)在316L不銹鋼支架材料和HNS支架材料表面,應(yīng)用二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽比色法(2methyl thiazole diphenyl tetrazolium bromide salt,MTT比色法)對HUVEC細(xì)胞活性進(jìn)行了檢測即體外細(xì)胞相容性評價。3.在體實(shí)驗(yàn)研究:將316L不銹鋼支架和HNS支架植入健康家豬冠狀動脈,分別于支架植入后28天和6個月應(yīng)用定量冠脈造影檢測血管的狹窄程度和晚期管腔丟失,而后取支架植入段的冠脈進(jìn)行組織學(xué)檢測和掃描電鏡觀察,最后應(yīng)用Q-PCR方法檢測植入支架的血管內(nèi)皮VEGF-A和b-FGFmRNA的表達(dá)。4.離體實(shí)驗(yàn)研究:將HUVEC細(xì)胞與316L不銹鋼金屬材料和HNS支架材料共培養(yǎng),于共培養(yǎng)1天和3天應(yīng)用ELISA方法檢測培養(yǎng)液中HUVEC釋放的IL-6含量;于1,3,5天分別應(yīng)用熒光顯微鏡觀察HUVEC細(xì)胞增殖情況;應(yīng)用western blot方法檢測培養(yǎng)7天的HUVEC細(xì)胞內(nèi)p-STAT3,ERK1/2表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.316L不銹鋼組及HNS支架組表面的溶血率均5%,兩組溶血率比較無差異;與316L不銹鋼支架相比,HNS組支架在吸附白蛋白及纖維蛋白方面無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);與316不銹鋼組相比,HNS組表面吸附血小板數(shù)量明顯減少,具有統(tǒng)計學(xué)差異(4.18±0.54×10~9/L比5.48±0.89×10~9/L,P0.05)。2.應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞活性結(jié)果顯示:無論是在培養(yǎng)24小時和72小時時,HNS組與316L不銹鋼HUVEC細(xì)胞活性無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)3.在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)316L不銹鋼支架和HNS支架植入1個月時的造影結(jié)果顯示HNS支架組在直徑狹窄百分比和LLL上未見明顯差別(D%:32.3±7.3%比32.2±11.3%,P0.05;LLL:0.99±0.25比0.98±0.34,P0.05),而6個月時的造影結(jié)果顯示HNS支架組在直徑狹窄百分比(35.9±10.2%比53.5±20.8%,P0.05)和LLL(1.08±0.27mm比1.61±0.68mm,P0.05)上均優(yōu)于316L不銹鋼支架組。(2)1個月時無論在大體標(biāo)本還是通過掃描電鏡的觀察,HNS組和316L組支架均已被內(nèi)膜覆蓋。(3)測量6個月時對兩組支架組織學(xué)HE染色的切片結(jié)果顯示:HNS組管腔面積較316L組大(3.46±1.49mm~2比1.91±1.04mm~2,P0.05),具有統(tǒng)計學(xué)差異。在管腔面積狹窄百分比方面HNS組小于316L組(54.0±17.8%比73.6±14.5,P0.05),具有統(tǒng)計學(xué)差異。在反映支架周圍炎癥情況的炎癥指數(shù)方面,HNS支架組明顯優(yōu)于316L不銹鋼組(1.71±0.43比2.68±0.57,P0.05)。(4)在28天及6個月的隨訪時間點(diǎn)內(nèi),HNS組及316L組均無實(shí)驗(yàn)動物死亡或發(fā)生ST。(5)支架植入28天后,HNS組支架表面覆蓋內(nèi)膜組織VEGF-A mRNA表達(dá)與316L組無差異(0.99±0.16比1.08±0.09,P0.05);316L組支架植入6個月后覆蓋支架表面的內(nèi)膜組織表達(dá)的VEGF-A mRNA明顯高于HNS組(2.86±0.8比1.66±0.22,P0.01);而無論28天或6個月時支架表面覆蓋內(nèi)膜組織的b-FGFmRNA表達(dá),316L組和HNS組之間均無差異(P0.05)。4.離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果:將HUVEC和316L不銹鋼材料與HNS支架材料共培養(yǎng)1,3,5天后觀察到HNS表面細(xì)胞數(shù)均少于316L不銹鋼組;HUVEC培養(yǎng)一天后316L組(0.31±0.054 pg/ml)釋放的IL-6水平明顯高于HNS組(0.23±0.02pg/ml,P0.01);HUVEC培養(yǎng)3天后316L組(0.35±0.087 pg/ml)釋放的IL-6水平也高于HNS組(0.26±0.02 pg/ml,P0.05);Western blot結(jié)果顯示培養(yǎng)7天后,在HNS支架表面生長的HUVECs中p-STAT3表達(dá)(0.2101±0.005)明顯低于在316L組(0.2485±0.006,P0.05);ERK1/2在HNS表面生長的HUVEC中的表達(dá)(0.671±0.016)也是明顯低于316L組(0.829±0.054,P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論新型低鎳高氮不銹鋼冠脈支架具有良好的體外組織相容性。其可以降低支架術(shù)后的內(nèi)膜增生。其動物實(shí)驗(yàn)的安全性(死亡及ST)與316L不銹鋼支架一致。新型低鎳高氮冠脈支架可能是通過IL-6/STAT3通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)而減少支架內(nèi)膜增生。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R541.4
【圖文】：

圖 1.1 DES 的基本結(jié)構(gòu)組成4 未來針對 ISR 的冠脈器械發(fā)展方向4.1 DES 的改進(jìn)從 DES 的演變過程我們可以發(fā)現(xiàn)，對于 DES 的優(yōu)化和改進(jìn)主要是優(yōu)化藥物的動力學(xué)、改進(jìn)藥物的載體和金屬平臺（見表 4），最終減少藥物的副作用低血管對異物的不良反應(yīng)。針對 ISR 的機(jī)制，新 代的 DES 對支架三個主要組成部分都進(jìn)行了改進(jìn)，到了臨床應(yīng)用的驗(yàn)證，無論從安全性還是療效均優(yōu)于前 代 DES。下面我們這三方面對新 代的 DES 進(jìn)行詳細(xì)說明：（1）抗增殖藥物：理想的抗增殖藥物必須滿足三個要求：使內(nèi)皮細(xì)胞盡成內(nèi)皮化的同時還可以抑制新生內(nèi)膜的增生，具有廣泛的治療窗以及親脂

圖 2.1 不同材料溶血率情況蛋白吸附實(shí)驗(yàn)NS 組吸附白蛋白的數(shù)量為 15.37±0.48μg/μl，而 316L 組為 1g/μl，兩組無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。HNS 組吸附纖維蛋白的數(shù)量為7μg/μl，而 316L 組為 2.15±0.35μg/μl，兩組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 2.4，圖 2.2）。表 2.4 不同材料對蛋白吸附數(shù)量的比較白蛋白（μg/μl） 纖維蛋白（μg/μl）不銹鋼組 16.58±0.56 2.15±0.35 15.37±0.48 2.08±0.27

圖 2.2 不同支架材料吸附蛋白量（μg/μl）2.4.3 血小板吸附實(shí)驗(yàn)血小板吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HNS組鋼板表面吸附血小板數(shù)量較316組少（4.1±0.54×109/L 比 5.48±0.89×109/L，P＜0.05）（見表 2.4 和圖 2.3）。表 2.4 不同材料對血小板吸附數(shù)量的比較名稱 316L 組（n=6）HNS 組（n=6）血小板計數(shù)（109/L） 5.48±0.89 4.18±0.54*注：與 316L 組比較 *P＜0.05

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