【摘要】：目的再生障礙性貧血(Aplastic anemia,AA)簡稱再障,是由多種病因導致的骨髓衰竭性疾病,表現(xiàn)為骨髓增生低下、全血細胞減少,臨床以貧血、出血和感染為主要表現(xiàn)。目前,AA的發(fā)病原因尚不明確,可能與物理射線、化學藥物、病毒及遺傳因素有關。AA的發(fā)病機制復雜,主要涉及造血干/祖細胞缺陷、免疫異常和造血微環(huán)境的破壞。AA的發(fā)病率呈雙峰分布曲線,其中一個峰值出現(xiàn)在15~25歲之間,第二個峰值出現(xiàn)在60歲以上,男女發(fā)病率無明顯差別。臨床治療主要有造血干細胞移植治療和免疫抑制治療兩種方法,但二者均具有其缺點和局限性。因此,尋找更為安全有效的治療方法仍是目前研究的熱點。低強度脈沖超聲(Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)是以空化效應和機械效應為主的一種超聲波。前期實驗表明LIPUS治療顯著促進化療所致骨髓抑制動物骨髓有核細胞增殖,增加外周血白細胞、免疫球蛋白數(shù)量,降低腹瀉率和死亡率;并且LIPUS通過降低CD34陽性細胞表面黏附分子的表達,促進造血細胞向外周血的遷移;通過降低PU.1的表達,促進HSCs向粒細胞和淋巴細胞的分化。本研究旨在構建苯和環(huán)磷酰胺所致的新西蘭兔AA動物模型,探索LIPUS治療AA的有效性及作用機制。方法1.采用苯和環(huán)磷酰胺聯(lián)合建立AA動物模型:苯1.0 ml/kg,注射8次,環(huán)磷酰胺15 mg/kg,注射3次,這為一個給藥周期,共給藥3個周期。建立骨髓增生減低、三系血細胞減少的新西蘭兔AA模型。2.16只AA模型兔隨機分為對照組和LIPUS組,每組8只。LIPUS組每日于一側股骨干骺端進行1次超聲輻照(0.2 W/cm~2,0.6 MHz,20min),持續(xù)30天。對照組接受假輻照。觀察新西蘭兔的一般情況,血常規(guī)檢測外周血血細胞計數(shù),骨髓組織病理切片觀察骨髓增殖情況,ELISA檢測外周血免疫相關分子的變化。3.細胞實驗分為4組,BMSC組:BMSCs單獨培養(yǎng);BMSC+Th17組:首先將BMSCs接種于六孔板,待其鋪滿后加入Th17細胞;BMSC+Th17+LIPUS組:首先將BMSCs接種于六孔板,待其鋪滿后加入Th17細胞,共培養(yǎng)的細胞過夜后進行1次LIPUS輻照(30mW/cm~2,0.6 MHz,20min);Th17組:Th17細胞單獨培養(yǎng)。四組細胞同時進行種板及樣本收集。ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-17A和IL-17F的水平;RT-PCR及WB檢測Th17細胞STAT3的表達水平。結果1.32只新西蘭兔給藥前WBCs、RBCs、PLTs和HGB計數(shù)分別為:15.13±5.12×10~9/L、8.82±0.58×10~(12)/L、234±107×10~9/L和311±20g/L,給藥結束后分別為:5.55±5.55×10~9/L、7.06±0.54×10~(12)/L、167±35×10~9/L和251±14g/L。模型兔WBCs、RBCs、PLTs和HGB計數(shù)分別下降63.3%、20.0%、28.6%和19.3%,且與正常兔相比差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。正常新西蘭兔骨髓造血組織豐富,細胞增殖活躍;模型兔骨髓組織的正常結構被破壞,造血組織減少,脂肪組織增加,骨髓小�？仗�,造血細胞減少。2.模型兔出現(xiàn)活動減少、反應遲鈍、食物和水攝入量減少、脫發(fā)等癥狀,LIPUS輻照后這些癥狀有所改善。LIPUS組死亡1只(12.5%),對照組死亡2只(25%),兩組死亡率無統(tǒng)計學差異(P0.05)。實驗第151天時:LIPUS組WBCs、RBCs、PLTs和HGB計數(shù)分別是11.53±6.38×10~9/L、10.12±0.83×10~(12)/L、239±32×10~9/L和253±11g/L;對照組WBCs、RBCs、PLTs和HGB計數(shù)分別是9.23±3.70×10~9/L、8.56±0.60×10~(12)/L、149±32×10~9/L和224±13g/L;兩組RBCs、PLTs和HGB計數(shù)有統(tǒng)計學差異(P0.05)。與實驗第93天時相比,實驗第123天時,對照組骨髓有核細胞計數(shù)無明顯改變(P0.05),而LIPUS組則顯著升高,甚至超過了正常兔(P0.05)。LIPUS治療后,血清FOXP3水平升高,IL-17水平卻明顯下降,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。LIPUS治療后,LIPUS組和對照組血清IL-4和IFN-γ水平的變化趨勢相同,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.LIPUS輻照后0.5小時,Th17細胞STAT3蛋白表達水平最低,是LIPUS抑制作用表現(xiàn)最明顯的時刻,此時采集標本最佳。WB和PCR檢測表明:BMSCs可抑制Th17細胞STAT3基因的表達,并且LIPUS可直接或通過BMSCs間接抑制Th17細胞STAT3基因的表達。ELISA檢測表明:Th17細胞可抑制BMSCs分泌IL-6,LIPUS可直接或通過Th17細胞間接抑制BMSCs分泌IL-6。結論1.調(diào)整后的給藥方法可建立骨髓增生減低、外周血三系細胞減少的新西蘭兔AA動物模型。2.LIPUS不僅可升高外周血WBCs、RBCs、PLTs和HGB的數(shù)量,促進骨髓有核細胞的增殖,改善骨髓脂肪化的狀態(tài);還可以調(diào)節(jié)外周血免疫分子的水平,糾正免疫分子的異常。3.LIPUS可直接或通過減少BMSCs分泌IL-6間接抑制Th17細胞分泌IL-17,進而改善模型兔FOXP3/IL-17比例失衡狀態(tài)。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R556.5
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學博士研究生學位論文表 1.1 32 只正常兔的血細胞計數(shù)Tab 1.1 Blood cell count in 32 normal rabbitsItem WBCs (×109/L) RBCs (×1012/L) PLTs (×109/L) HGB(g/L)Average Value 15.13 8.82 234 311Standard Deviation 5.12 0.58 107 2095% Confidence Interval 11.5-17.0 8.46-9.20 178-217 296-3182.1.3 骨髓組織病理切片如圖 1.1 所示：正常新西蘭兔的骨髓組織結構完整，造血組織豐富，有核細胞增殖活躍。

圖 1.2 造模期間新西蘭兔白細胞的變化趨勢，*與 0 天相比，P < 0.05Fig 1.2 The change trend of WBCs in New Zealand rabbits during the modeling period* compared with 0 days, P< 0.05.2.2 紅細胞的變化趨勢如圖 1.3 所示：給藥的前 33 天新西蘭兔 RBCs 數(shù)目持續(xù)下降，第 33 天時 R為 7.10±0.91×1012/L，與 0 天相比，下降 19.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.至 43 天出現(xiàn)短暫的升高，隨后維持在相對穩(wěn)定的水平，第 63 天時 RBCs 8.09±0.73×1012/L；63 天之后 RBCs 計數(shù)呈波動性下降趨勢，93 天時降至最7.06±0.54×1012/L。

圖 1.3 造模期間新西蘭兔紅細胞的變化趨勢，*與 0 天相比，P < 0.05Fig 1.3 The change trend of RBCs in New Zealand rabbits during the modeling period* compared with 0 days, P< 0.05.2.3 血小板的變化趨勢如圖 1.4 所示：給藥的前 24 天新西蘭兔 PLTs 計數(shù)持續(xù)下降，第 24 天時 為 158±31×109/L，與 0 天相比，下降 32.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.033 至 73 天時 PLTs 保持相對穩(wěn)定；第 73 至 83 天之間 PLTs 計數(shù)迅速升高 PLTs 計數(shù)為 197±25×109/L，與 0 天相比，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05 PLTs 計數(shù)很快下降，達較低水平 167±35×109/L。

【參考文獻】

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本文編號：2788520