【摘要】：由于成體心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞,缺血性心臟病引起的心肌損傷不能通過自身再生來修復(fù),因此挽救梗死的心肌組織,恢復(fù)其原有的功能是治療缺血性心臟病的關(guān)鍵。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是常見的"種子細(xì)胞"。BMSCs在一定條件的誘導(dǎo)下,可以向多個(gè)方向分化,如成脂肪、骨、肌肉、神經(jīng)、心肌、內(nèi)皮等多類細(xì)胞組織,BMSCs還可以作為根源細(xì)胞來延緩衰老和修復(fù)疾病損傷的組織及器官。將誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞樣細(xì)胞的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,植入受損的心肌組織,對(duì)修復(fù)心肌損傷具有一定的作用。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因-2(Fibroblastgrowthfactor-2,FGF-2)是廣泛分布于體內(nèi)各種組織中的多功能生長(zhǎng)因子。它具有刺激各類干細(xì)胞的遷移、增殖、分化,促進(jìn)新生血管形成和保護(hù)心臟的作用。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展,通過基因轉(zhuǎn)染的方式改造干細(xì)胞已成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在基因修飾中,慢病毒載體是應(yīng)用最廣泛的基因載體,與質(zhì)粒、腺病毒等載體相比,它具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低、目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)。本研究通過構(gòu)建慢病毒載體將FGF-2基因轉(zhuǎn)染到BMSCs中,轉(zhuǎn)染BMSCs過表達(dá)FGF-2基因。探究FGF-2在BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化過程中的作用,比較基因轉(zhuǎn)染是否優(yōu)于直接誘導(dǎo)。期待借此提升細(xì)胞的分化效率,為臨床通過心肌細(xì)胞移植治療缺血性心臟病提供優(yōu)良的細(xì)胞來源。為探討慢病毒介導(dǎo)FGF-2轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的效率是否優(yōu)于FGF-2直接誘導(dǎo),本實(shí)驗(yàn)首先采用全骨髓貼壁法體外無菌條件下分離、培養(yǎng)BMSCs,對(duì)擴(kuò)增純化后的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果顯示,BMSC在6h后開始粘附并在24h后附著,此時(shí)細(xì)胞呈圓形并且具有較強(qiáng)的折光性;2d后,大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁,大多數(shù)是短紡錘形,也有少部分細(xì)胞呈不規(guī)則形;4d后,細(xì)胞體積開始變大,球形細(xì)胞逐漸減少;7d后細(xì)胞體積逐漸變大并開始向周圍擴(kuò)散,細(xì)胞大致呈平行排列。利用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)培養(yǎng)至第4代BMSCs進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明,CD45的陽性表達(dá)率為4.6%;CD29的陽性表達(dá)率為98.2%,CD90的陽性表達(dá)率為91.8%,符合BMSCs的特征。經(jīng)鑒定,培養(yǎng)至第4代的細(xì)胞為純化的BMSCs。誘導(dǎo)前,對(duì)FGF-2直接誘導(dǎo)的最佳誘導(dǎo)濃度和慢病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的最適病毒MOI值進(jìn)行篩選,通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知,FGF-2的最佳誘導(dǎo)濃度可能為1ng/ml,Lenti-FGF-2-GFP慢病毒最適轉(zhuǎn)染MOI值為150和Lenti-對(duì)照-GFP慢病毒最適轉(zhuǎn)染MOI值為100。對(duì)培養(yǎng)至第2代的細(xì)胞加入誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)72h后進(jìn)行換液,更換為不含誘導(dǎo)劑的IMDM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)加入誘導(dǎo)劑的不同分為以下4組:A組(BMSCs空白對(duì)照組)、B組(FGF-2誘導(dǎo)組)、C組(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)、D組(Lenti-對(duì)照-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)。誘導(dǎo)前通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳細(xì)胞誘導(dǎo)密度、最佳誘導(dǎo)濃度、最佳誘導(dǎo)時(shí)間。Real-timePCR檢測(cè)心肌早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2.5的表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GATA-4、Nkx2.5在各組細(xì)胞中均有表達(dá)。GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照,利用相對(duì)定量分析判斷GATA-4、Nkx2.5基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與A組(BMSCs空白對(duì)照組)相比,B組(FGF-2誘導(dǎo)組)、C組(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)誘導(dǎo)4W后GATA-4、Nkx2.5基因的表達(dá)增強(qiáng)。其中,C組(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)的GATA-4及Nkx2.5基因的相對(duì)表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均高于其他實(shí)驗(yàn)組。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法及免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、間隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)、結(jié)蛋白(Desmin)、原肌球蛋白(Tropomyosin,Tm)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,誘導(dǎo)4W后,cTnI、cTnT、Cx43、Desmin、Tm在各組細(xì)胞的胞質(zhì)中可見陽性表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析顯示,C組(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)中標(biāo)記物的積分光密度(IOD)值最強(qiáng)。A組(BMSCs空白對(duì)照組)D組(Lenti-對(duì)照-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)的Cx43和cTnI呈弱陽性或陰性表達(dá)。各誘導(dǎo)組間各標(biāo)記物的陽性表達(dá)存在顯著性差異。Western blot檢測(cè)原肌球蛋白(Tropomyosin,Tm)及結(jié)蛋白(Desmin)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,誘導(dǎo)4W后A組(BMSCs空白對(duì)照組)、B組(FGF-2誘導(dǎo)組)、C組(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)、D組(Lenti-對(duì)照-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)中Tm及Desmin均有表達(dá),其中C組(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)的Desmin陽性表達(dá)率高于其他實(shí)驗(yàn)組,B組(FGF-2誘導(dǎo)組)、C組(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)Tm的表達(dá)高于A組(BMSCs空白對(duì)照組)和D組(Lenti-對(duì)照-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)。統(tǒng)計(jì)分析,各實(shí)驗(yàn)組Desmin的陽性表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,B組(FGF-2誘導(dǎo)組)、C組(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染組)Tm的表達(dá)無顯著差異。透射電鏡結(jié)果顯示,經(jīng)FGF-2慢病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后的BMSCs細(xì)胞核呈卵圓形,位于細(xì)胞的中央,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見肌絲、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體等細(xì)胞器。符合心肌細(xì)胞發(fā)育過程中的結(jié)構(gòu)特征。由此實(shí)驗(yàn)可知:(1)FGF-2可轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。(2)慢病毒介導(dǎo)FGF-2轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的效率優(yōu)于FGF-2直接誘導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R541

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本文編號(hào)：2782473