發(fā)布時間：2020-08-03 15:22

【摘要】：研究背景及目的:胸主動脈夾層(Thoracic aortic dissection,TAD)是一種死亡率極高的主動脈急癥。TAD發(fā)生時,主動脈內(nèi)膜出現(xiàn)破口,破口處血液流入并導(dǎo)致主動脈中層撕裂成真假兩腔,因假腔內(nèi)血液無法及時有效排出,血液在假腔內(nèi)不斷累積并最終導(dǎo)致假腔破裂,病人急性死亡。若不給予積極干預(yù),TAD起病后的48小時內(nèi)約有50%的患者死亡。一些遺傳性疾病如馬凡氏綜合征、Ehlers-Danlos綜合征等可以引起TAD,但只有大約10%的TAD為遺傳性疾病引起。目前非遺傳性TAD的具體發(fā)病機(jī)制仍未能闡明,并且對于TAD尚無有效的預(yù)防及藥物治療手段。因此,對TAD發(fā)病機(jī)制的研究有利于在此基礎(chǔ)上探尋TAD的早期預(yù)防和藥物治療方法。已知主動脈壁中層是主動脈的主要功能結(jié)構(gòu),主動脈中層的功能異常是TAD發(fā)生的重要病理生理基礎(chǔ)。主動脈中層的主要細(xì)胞成分是血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs),其存在收縮型與合成型兩種表型。與收縮型相比,合成型VSMCs表現(xiàn)為更強(qiáng)的增殖、遷移能力以及高表達(dá)骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP2)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9),而收縮型VSMCs標(biāo)志物α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)與平滑肌蛋白22α(Smooth muscle 22α,SM22α)的表達(dá)水平則顯著下降。生理情況下主動脈內(nèi)VSMCs主要以收縮型存在,維持主動脈的正常功能。多項研究已經(jīng)表明VSMCs由收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)化參與了TAD的發(fā)生,在TAD的病理生理過程中有重要作用。然而,目前對于TAD中VSMCs表型轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制仍然了解甚少。NANOG是一種在維持胚胎干細(xì)胞增殖及全能性方面有重要作用同源域蛋白。在胚胎干細(xì)胞中,NANOG的持續(xù)表達(dá)可以維持其自我更新潛能及去分化狀態(tài)。相對的,NANOG的低表達(dá)可以引起胚胎干細(xì)胞分化。VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是一種去分化過程,故NANOG在干細(xì)胞中的功能高度提示其可能與VSMCs的表型轉(zhuǎn)化相關(guān)。但NANOG在TAD中VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用尚未見有報道。OPN蛋白高表達(dá)于TAD組織及合成型VSMCs。目前研究表明OPN直接促進(jìn)了VSMCs由收縮型向合成型的轉(zhuǎn)化,高表達(dá)的OPN能夠增強(qiáng)VSMCs的增殖和遷移能力,上調(diào)VSMCs中合成型標(biāo)志物MMP2的表達(dá)并下調(diào)收縮型標(biāo)記物α-SMA的表達(dá)。同時,有研究報道在胚胎干細(xì)胞中OPN的表達(dá)受NANOG調(diào)控,這高度提示了NANOG可能通過調(diào)控OPN參與了TAD中VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。本研究的目的是通過組織學(xué)及分子生物學(xué)的方法探究NANOG對TAD中VSMCs表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用及其機(jī)制。研究方法:(一)TAD標(biāo)本的收集與VSMCs的分離1.主動脈臨床標(biāo)本的收集:TAD組主動脈組織來自20例接受手術(shù)修復(fù)的TAD患者;正常對照組主動脈組織來自10例未患有主動脈及血管相關(guān)疾病的捐獻(xiàn)者。2.VSMCs的分離與培養(yǎng):原代VSMCs分離自TAD組以及對照組來源標(biāo)本。標(biāo)本離體經(jīng)去除內(nèi)外膜后剪切為約4mm~2大小組織塊,接種于24孔板,每孔加入200μl含有生長添加劑的M231培養(yǎng)基后經(jīng)貼壁培養(yǎng)取得原代VSMCs。原代VSMCs生長至融合時進(jìn)行傳代,組織塊則轉(zhuǎn)移至新的孔板中繼續(xù)分離細(xì)胞。(二)NANOG對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用及機(jī)制1.腺病毒轉(zhuǎn)染:VSMCs生長至匯合率約70%時,取半量培養(yǎng)基根據(jù)MOI加入適量體積的腺病毒制成感染培養(yǎng)基,加入感染培養(yǎng)基37℃下孵育2小時后補(bǔ)足培養(yǎng)基,孵育過夜后更換至不含病毒培養(yǎng)基,24小時后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。2.siRNA轉(zhuǎn)染:根據(jù)Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的操作手冊進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。3.免疫組織化學(xué):主動脈組織經(jīng)10%福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋后切片,組織切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、抑制內(nèi)源性過氧化物酶、封閉、孵育一抗及二抗后采用DAB顯色液顯色。4.qRT-PCR與Western blot:qRT-PCR用于檢測樣本中目的基因mRNA表達(dá)水平,Western blot用于檢測樣本中目的蛋白表達(dá)水平。5.細(xì)胞增殖實驗:采用CCK8法檢測VSMCs增殖水平。6.劃痕實驗:劃痕實驗用于檢測細(xì)胞的水平方向遷移能力。7.Transwell遷移實驗:Transwell遷移實驗用于檢測細(xì)胞的垂直方向趨化遷移能力。8.Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞凋亡實驗:紫外線照射(10J/m~2)被用于誘導(dǎo)VSMCs凋亡,細(xì)胞經(jīng)Annexin V/PI雙標(biāo)記后通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析凋亡細(xì)胞的比例。9.TUNEL細(xì)胞凋亡實驗:VSMCs經(jīng)4%多聚甲醛固定、透膜后加入生物素標(biāo)記的dUTP與脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶孵育,最后經(jīng)熒光染色后熒光顯微鏡下檢測凋亡細(xì)胞比例。10.免疫熒光:VSMCs經(jīng)75%乙醇水溶液固定后,經(jīng)透膜、封閉、一抗及二抗孵育、染核后熒光顯微鏡下觀察。11.染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP):根據(jù)EpiQuik ChIP試劑盒中的操作手冊所提供的步驟進(jìn)行ChIP實驗。(三)實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)采用非配對Student t檢驗。統(tǒng)計學(xué)分析均在SPSS中完成。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。P小于0.05認(rèn)為在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著性差異。研究結(jié)果:(一)TAD來源的主動脈組織及VSMCs中高表達(dá)NANOG,同時伴隨有VSMCs表型轉(zhuǎn)化qRT-PCR、Western blot及免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示TAD主動脈組織中NANOG的mRNA及蛋白水平均顯著上調(diào),同時伴隨著VSMCs合成型標(biāo)志物OPN與MMP2的表達(dá)上調(diào)及收縮型標(biāo)志物α-SMA與SM22α的表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步對VSMCs的檢測在細(xì)胞水平上驗證了上述發(fā)現(xiàn),細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示TAD來源VSMCs中高表達(dá)的NANOG主要分布于細(xì)胞核,同時伴隨著胞漿中OPN的表達(dá)升高與SM22α的表達(dá)降低。本部分的結(jié)果說明NANOG可能參與調(diào)控了TAD中VSMCs表型轉(zhuǎn)化。(二)NANOG促進(jìn)了VSMCs由收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)化VSMCs中過表達(dá)NANOG上調(diào)了VSMCs合成型標(biāo)志物OPN與MMP2的表達(dá)并下調(diào)了收縮型標(biāo)志物α-SMA與SM22α的表達(dá)。同時,CCK8增殖實驗結(jié)果顯示過表達(dá)NANOG增強(qiáng)了VSMCs的增殖能力。劃痕實驗與Transwell遷移實驗結(jié)果顯示過表達(dá)NANOG增強(qiáng)了VSMCs在水平方向和垂直方向的遷移能力。流式細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果表明NANOG的過表達(dá)增強(qiáng)了VSMCs的抗凋亡能力。TUNEL實驗的結(jié)果驗證了流式細(xì)胞凋亡實驗的結(jié)果,NANOG過表達(dá)組的VSMCs凋亡比例較對照組顯著下降。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示在TAD來源的VSMCs中干擾敲低NANOG的表達(dá)上調(diào)了收縮型標(biāo)志物α-SMA與SM22α的表達(dá)同時下調(diào)了合成型標(biāo)志物OPN與MMP2的表達(dá)。本部分的結(jié)果說明高表達(dá)的NANOG可以調(diào)控VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化,并且這一功能可能是通過OPN實現(xiàn)。(三)NANOG通過直接上調(diào)OPN的表達(dá)促進(jìn)了VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化ChIP實驗結(jié)果顯示NANOG可以直接結(jié)合至OPN基因的啟動子區(qū)域。在進(jìn)一步的拯救實驗中,在過表達(dá)NANOG的VSMCs中敲低OPN引起了收縮型標(biāo)志物α-SMA與SM22α的表達(dá)上調(diào),同時合成型標(biāo)志物MMP2的表達(dá)水平下調(diào)。CCK8增殖實驗、劃痕實驗、Transwell遷移實驗、流式凋亡實驗及TUNEL實驗的結(jié)果顯示敲低OPN阻止了過表達(dá)NANOG引起的VSMCs增殖、遷移及抗凋亡能力增強(qiáng)。本部分的結(jié)果說明NANOG通過直接上調(diào)OPN的表達(dá)促進(jìn)了TAD中VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。研究結(jié)論:我們的研究結(jié)果說明NANOG高表達(dá)于TAD患者的主動脈組織及VSMCs,高表達(dá)的NANOG通過直接上調(diào)OPN的表達(dá)促進(jìn)了VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.1
【圖文】：

軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文h）、棄掉板孔內(nèi)的 DAPI，PBS 沖洗三次。取出細(xì)胞爬片并使用防淬滅封片液后置于正置熒光顯微鏡下觀察，記錄典型圖像。拍照完成的細(xì)胞爬片應(yīng)保存在-20緩熒光粹滅。二、結(jié)果（一）NANOG 在 TAD 主動脈中的表達(dá)水平較正常主動脈顯高本部分中，首先用 qRT-PCR 與 Western blot 的方法檢測了 TAD 主動脈組織及對照組織中 NANOG 的 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn) TAD 主動脈組織ANOG 的 mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對照主動脈（圖 1-1）。

1-2 對照組與 TAD 組主動脈中的 NANOG 免疫組織染色。（二）TAD 主動脈組織中的 VSMCs 由收縮型向合成型表型1、TAD 主動脈組織中合成型 VSMCs 的標(biāo)志物表達(dá)水平升高qRT-PCR 以及 Western 的結(jié)果顯示 TAD 主動脈組織中 VSMCs 合成型的標(biāo)志PN 及 MMP2 的 mRNA 及蛋白表達(dá)水平較正常對照組顯著上調(diào)（圖 1-3）。

對照組與TAD組主動脈中的NANOG免疫組織染色

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 唐楊烽;張錫武;談夢偉;徐激斌;徐志云;;胸主動脈夾層血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化研究[J];中國血管外科雜志(電子版);2013年02期

本文編號：2779819