【摘要】：目的:動(dòng)脈粥樣硬化是一種常見(jiàn)的大動(dòng)脈性疾病,由動(dòng)脈粥樣硬化引起的急性心血管事件占據(jù)世界死亡因素的首位。血管新生貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊形成的全過(guò)程,是促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定性和誘導(dǎo)嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生的一大關(guān)鍵因素。氧化應(yīng)激可以直接造成內(nèi)皮損傷從而誘導(dǎo)血管新生的發(fā)生。microRNA是一類(lèi)短的非編碼小RNA,其可以通過(guò)調(diào)控與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡等有關(guān)的mRNA來(lái)調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞生物學(xué)功能的過(guò)程。研究表明,microRNA與動(dòng)脈粥樣硬化血管新生的形成密切相關(guān),廣泛參與了血管新生因子的調(diào)控,是研究和防治動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),TLR4可以促進(jìn)內(nèi)皮氧化損傷,誘導(dǎo)血管新生的發(fā)生,我們用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了可以調(diào)控TLR4的microRNA,并且發(fā)現(xiàn)miR-140在氧化應(yīng)激的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)具有顯著性差異。本課題以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和ApoE~(-/-)小鼠為研究對(duì)象,研究miR-140靶向TLR4調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)下血管新生的作用及機(jī)制,為臨床對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化血管新生診斷和治療的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。方法:1、篩選最佳的LPC濃度,建立氧化應(yīng)激HUVE-12細(xì)胞模型;2、制備過(guò)表達(dá)和沉默表達(dá)TLR4的慢病毒載體,包裝成功后轉(zhuǎn)染HUVE-12細(xì)胞,建立穩(wěn)定表達(dá)TLR4的HUVE-12細(xì)胞,用RT-qPCR檢測(cè)驗(yàn)證TLR4的轉(zhuǎn)染表達(dá)效率,再用30μM LPC處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激;3、制備過(guò)表達(dá)和沉默表達(dá)miR-140的質(zhì)粒載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HUVE-12細(xì)胞,用RT-qPCR檢測(cè)驗(yàn)證miR-140的轉(zhuǎn)染表達(dá)效率,再用30μM LPC處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激;4、LDH和CCK8試劑盒檢測(cè)HUVE-12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷情況,以及TLR4和miR-140對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響作用;5、WB、IF、RT-qPCR檢測(cè)氧化應(yīng)激的HUVE-12細(xì)胞TLR4、VEGFA、miR140的表達(dá)情況,以及TLR4和miR-140對(duì)氧化應(yīng)激的細(xì)胞TLR4、VEGFA、miR140表達(dá)的影響作用;6、Matrigel小管形成實(shí)驗(yàn)和CAM血管新生實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氧化應(yīng)激的HUVE-12血管新生情況,以及TLR4和miR-140對(duì)氧化應(yīng)激的細(xì)胞血管新生的影響作用;7、過(guò)表達(dá)或沉默表達(dá)TLR4的HUVE-12細(xì)胞,同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-140,再用30μM LPC處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激;觀察miR-140靶向TLR4調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激血管新生的作用;雙螢光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-140和TLR4的靶向關(guān)系。8、6-7周齡SPF級(jí)ApoE~(-/-)和TLR4~(-/-)小鼠合籠雜交,建立ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)小鼠,篩選和鑒定小鼠基因型后,用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠16周建立AS模型小鼠;9、檢測(cè)AS小鼠血脂水平,用體式顯微鏡觀察小鼠主動(dòng)脈壁上斑塊形成情況,HE染色觀察斑塊內(nèi)病理組織結(jié)構(gòu),油紅O染色檢測(cè)斑塊內(nèi)脂質(zhì)浸潤(rùn)情況,來(lái)觀察TLR4對(duì)AS小鼠血脂水平以及脂質(zhì)斑塊形成的影響作用;10、IHC、IF檢測(cè)AS小鼠VEGFA、VEGFAR2、vWF表達(dá)量,觀察TLR4對(duì)AS小鼠斑塊血管新生的影響作用;11、RT-qPCR、WB檢測(cè)觀察AS小鼠TLR4、VEGFA、miR-140的表達(dá)量;12、Masson染色檢測(cè)AS小鼠斑塊內(nèi)膠原纖維含量,觀察TLR4對(duì)AS小鼠斑塊穩(wěn)定性的影響作用;13、Pearson相關(guān)性分析法分析在AS小鼠中miR-140、TLR4、VEGFA之間的相關(guān)性。結(jié)果:1、30μM LPC為最佳的氧化應(yīng)激細(xì)胞造模濃度;2、氧化應(yīng)激的HUVE-12細(xì)胞TLR4和VEGF表達(dá)量增高,miR-140表達(dá)量降低;3、氧化應(yīng)激的HUVE-12誘導(dǎo)血管新生增強(qiáng);4、熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光表達(dá)率在90%以上,與空載對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)TLR4的細(xì)胞TLR4表達(dá)量升高約70倍,沉默表達(dá)TLR4的細(xì)胞TLR4表達(dá)量降低約50倍;5、與空載對(duì)照組比較,miR-140過(guò)表達(dá)細(xì)胞的miR-140表達(dá)量升高約20倍,miR-140沉默表達(dá)的細(xì)胞miR-140表達(dá)量降低約10倍6、過(guò)表達(dá)TLR4促進(jìn)氧化應(yīng)激的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、小管形成和CAM血管新生,增加VEGFA的表達(dá)量、降低miR-140表達(dá)量;沉默表達(dá)TLR4減少氧化應(yīng)激的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、小管形成和CAM血管新生,降低VEGFA的表達(dá)量、增加miR-140表達(dá)量。7、過(guò)表達(dá)miR-140減少氧化應(yīng)激的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、小管形成和CAM血管新生,減少TLR4、VEGFA的表達(dá)量;沉默表達(dá)miR-140促進(jìn)氧化應(yīng)激的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞小管形成和CAM血管新生,增強(qiáng)VEGFA、TLR4的表達(dá)量。8、過(guò)表達(dá)miR-140減少過(guò)表達(dá)TLR4的氧化應(yīng)激細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷、小管形成和CAM血管新生,降低TLR4、VEGFA表達(dá)量降低;過(guò)表達(dá)miR-140對(duì)沉默表達(dá)TLR4的氧化應(yīng)激細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷、小管形成和CAM血管新生以及VEGFA表達(dá)量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。9、雙螢光素酶結(jié)果顯示,miR-140顯著抑制TLR4報(bào)告基因螢光信號(hào),相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)突變后,TLR4報(bào)告基因螢光信號(hào)上調(diào)。10、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示ApoE~(-/-)和ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)小鼠分別在254、140bp條帶處顯影。11、高脂飼養(yǎng)小鼠16周后,ApoE~(-/-)和ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)小鼠主動(dòng)脈壁上均有斑塊形成并合并不同程度的脂質(zhì)浸潤(rùn),且小鼠血脂水平升高。12、ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)組小鼠較ApoE~(-/-)組小鼠主動(dòng)脈壁上粥樣硬化斑塊形成和脂質(zhì)浸潤(rùn)減少,血脂水平降低,VEGFA、VEGFR2、vWF表達(dá)量降低,miR-140表達(dá)量增高,斑塊內(nèi)膠原纖維含量增高;13、相關(guān)性分析結(jié)果顯示TLR4與VEGFA表達(dá)量呈正相關(guān)性,miR-140與TLR4、VEGFA的表達(dá)量均為負(fù)相關(guān)性。結(jié)論:1、TLR4促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管新生。2、miR-140靶向負(fù)調(diào)控TLR4抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管新生。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R54
【圖文】：

1.3.1 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)血管新生1.3.1.1 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的建立在本實(shí)驗(yàn)中，分別用 5、10、20、30、50、100μM 濃度的 LPC 處理 HUVE-12細(xì)胞 24 小時(shí)后，LDH 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷情況，結(jié)果顯示，與 NC 組比較，在 30μM 濃度時(shí)細(xì)胞 LDH 釋放量開(kāi)始呈濃度梯度升高而增高（NC:8.296±0.246，30μM:13.020±0.656，50μM:20.756±0.265，100μM:33.883±0.220，P＜0.05）（圖 1-1A）；CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞增殖活力在30μM 濃度時(shí)開(kāi)始呈濃度梯度升高而下降（NC: 6.456±0.4081，30μM:4.92±0.317，50μM:2.866±0.221，100μM:2.0967±0.198，P＜0.05）（圖 1-1B），在50μM 濃度后細(xì)胞增殖活力明顯受到抑制而不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，因此在本課題實(shí)驗(yàn)中選用 30μM 濃度的 LPC 誘導(dǎo)損傷 HUVE-12 細(xì)胞，建立氧化應(yīng)激損傷模型細(xì)胞，此濃度也與本課題組前期實(shí)驗(yàn)中的濃度一致。

碩士學(xué)位論文1.3.1.2 氧化應(yīng)激的 HUVE-12 細(xì)胞 TLR4、VEGFA 表達(dá)量增高，miR-140表達(dá)量降低（1） WB 檢測(cè)細(xì)胞 TLR4、VEGFA 蛋白的表達(dá)量上述結(jié)果中可得知氧化應(yīng)激狀態(tài)下可以促使 HUVE-12 細(xì)胞血管新生增強(qiáng)，為了進(jìn)一步研究其機(jī)制，我們首先用 WB 檢測(cè)了 TLR4 的表達(dá)量，結(jié)果顯示 LPC30μM 組較 NC 組 TLR4 的表達(dá)量明顯增高（NC: 157.333±5.033，LPC 30: 213±7.211，P＜0.05）；此外檢測(cè) VEGFA 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示 LPC 30μM 組較 NC 組 VEGFA 表達(dá)量亦顯著增高（NC: 167±8.185，LPC 30: 217±5.567，P＜0.05）（圖 1-2）。

圖 1-3 IF 檢測(cè)氧化應(yīng)激的 HUVE-12 細(xì)胞內(nèi) VEGFA 蛋IF detection of oxidative stress in VEGFA protein expression of VEGFA protein in LPC 30μM group is increased, bin (Alexa Fluor594 fluorescent secondary antibody), 40X, scal group, P < 0.05.qPCR 檢測(cè)細(xì)胞 TLR4、VEGFAmRNA 的表達(dá)量和PCR 結(jié)果顯示，用 30μM LPC 誘導(dǎo)細(xì)胞氧應(yīng)激后，mRNA 的表達(dá)量升高（NC: 1，LPC 30: 2.95±0.03，P 組較 NC 組 VEGFA mRNA 的表達(dá)量亦升高（NC0.05）（圖 1-4B），LPC 30μM 組較 NC 組 miR-141，LPC 30: 0.38±0.03，P＜0.05）（圖 1-4C）。

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本文編號(hào)：2777139