發(fā)布時間：2020-08-01 07:10

【摘要】：目的:動脈粥樣硬化是一種常見的大動脈性疾病,由動脈粥樣硬化引起的急性心血管事件占據(jù)世界死亡因素的首位。血管新生貫穿于動脈粥樣硬化易損斑塊形成的全過程,是促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定性和誘導(dǎo)嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生的一大關(guān)鍵因素。氧化應(yīng)激可以直接造成內(nèi)皮損傷從而誘導(dǎo)血管新生的發(fā)生。microRNA是一類短的非編碼小RNA,其可以通過調(diào)控與細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡等有關(guān)的mRNA來調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞生物學(xué)功能的過程。研究表明,microRNA與動脈粥樣硬化血管新生的形成密切相關(guān),廣泛參與了血管新生因子的調(diào)控,是研究和防治動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的一個潛在靶點。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),TLR4可以促進(jìn)內(nèi)皮氧化損傷,誘導(dǎo)血管新生的發(fā)生,我們用生物信息學(xué)方法預(yù)測了可以調(diào)控TLR4的microRNA,并且發(fā)現(xiàn)miR-140在氧化應(yīng)激的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)具有顯著性差異。本課題以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和ApoE~(-/-)小鼠為研究對象,研究miR-140靶向TLR4調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)下血管新生的作用及機制,為臨床對動脈粥樣硬化血管新生診斷和治療的新靶點奠定基礎(chǔ)。方法:1、篩選最佳的LPC濃度,建立氧化應(yīng)激HUVE-12細(xì)胞模型;2、制備過表達(dá)和沉默表達(dá)TLR4的慢病毒載體,包裝成功后轉(zhuǎn)染HUVE-12細(xì)胞,建立穩(wěn)定表達(dá)TLR4的HUVE-12細(xì)胞,用RT-qPCR檢測驗證TLR4的轉(zhuǎn)染表達(dá)效率,再用30μM LPC處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激;3、制備過表達(dá)和沉默表達(dá)miR-140的質(zhì)粒載體,瞬時轉(zhuǎn)染HUVE-12細(xì)胞,用RT-qPCR檢測驗證miR-140的轉(zhuǎn)染表達(dá)效率,再用30μM LPC處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激;4、LDH和CCK8試劑盒檢測HUVE-12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷情況,以及TLR4和miR-140對細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響作用;5、WB、IF、RT-qPCR檢測氧化應(yīng)激的HUVE-12細(xì)胞TLR4、VEGFA、miR140的表達(dá)情況,以及TLR4和miR-140對氧化應(yīng)激的細(xì)胞TLR4、VEGFA、miR140表達(dá)的影響作用;6、Matrigel小管形成實驗和CAM血管新生實驗檢測氧化應(yīng)激的HUVE-12血管新生情況,以及TLR4和miR-140對氧化應(yīng)激的細(xì)胞血管新生的影響作用;7、過表達(dá)或沉默表達(dá)TLR4的HUVE-12細(xì)胞,同時瞬時轉(zhuǎn)染miR-140,再用30μM LPC處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激;觀察miR-140靶向TLR4調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激血管新生的作用;雙螢光素酶報告基因驗證miR-140和TLR4的靶向關(guān)系。8、6-7周齡SPF級ApoE~(-/-)和TLR4~(-/-)小鼠合籠雜交,建立ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)小鼠,篩選和鑒定小鼠基因型后,用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠16周建立AS模型小鼠;9、檢測AS小鼠血脂水平,用體式顯微鏡觀察小鼠主動脈壁上斑塊形成情況,HE染色觀察斑塊內(nèi)病理組織結(jié)構(gòu),油紅O染色檢測斑塊內(nèi)脂質(zhì)浸潤情況,來觀察TLR4對AS小鼠血脂水平以及脂質(zhì)斑塊形成的影響作用;10、IHC、IF檢測AS小鼠VEGFA、VEGFAR2、vWF表達(dá)量,觀察TLR4對AS小鼠斑塊血管新生的影響作用;11、RT-qPCR、WB檢測觀察AS小鼠TLR4、VEGFA、miR-140的表達(dá)量;12、Masson染色檢測AS小鼠斑塊內(nèi)膠原纖維含量,觀察TLR4對AS小鼠斑塊穩(wěn)定性的影響作用;13、Pearson相關(guān)性分析法分析在AS小鼠中miR-140、TLR4、VEGFA之間的相關(guān)性。結(jié)果:1、30μM LPC為最佳的氧化應(yīng)激細(xì)胞造模濃度;2、氧化應(yīng)激的HUVE-12細(xì)胞TLR4和VEGF表達(dá)量增高,miR-140表達(dá)量降低;3、氧化應(yīng)激的HUVE-12誘導(dǎo)血管新生增強;4、熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光表達(dá)率在90%以上,與空載對照組比較,過表達(dá)TLR4的細(xì)胞TLR4表達(dá)量升高約70倍,沉默表達(dá)TLR4的細(xì)胞TLR4表達(dá)量降低約50倍;5、與空載對照組比較,miR-140過表達(dá)細(xì)胞的miR-140表達(dá)量升高約20倍,miR-140沉默表達(dá)的細(xì)胞miR-140表達(dá)量降低約10倍6、過表達(dá)TLR4促進(jìn)氧化應(yīng)激的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、小管形成和CAM血管新生,增加VEGFA的表達(dá)量、降低miR-140表達(dá)量;沉默表達(dá)TLR4減少氧化應(yīng)激的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、小管形成和CAM血管新生,降低VEGFA的表達(dá)量、增加miR-140表達(dá)量。7、過表達(dá)miR-140減少氧化應(yīng)激的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、小管形成和CAM血管新生,減少TLR4、VEGFA的表達(dá)量;沉默表達(dá)miR-140促進(jìn)氧化應(yīng)激的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞小管形成和CAM血管新生,增強VEGFA、TLR4的表達(dá)量。8、過表達(dá)miR-140減少過表達(dá)TLR4的氧化應(yīng)激細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷、小管形成和CAM血管新生,降低TLR4、VEGFA表達(dá)量降低;過表達(dá)miR-140對沉默表達(dá)TLR4的氧化應(yīng)激細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷、小管形成和CAM血管新生以及VEGFA表達(dá)量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。9、雙螢光素酶結(jié)果顯示,miR-140顯著抑制TLR4報告基因螢光信號,相應(yīng)結(jié)合位點突變后,TLR4報告基因螢光信號上調(diào)。10、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示ApoE~(-/-)和ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)小鼠分別在254、140bp條帶處顯影。11、高脂飼養(yǎng)小鼠16周后,ApoE~(-/-)和ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)小鼠主動脈壁上均有斑塊形成并合并不同程度的脂質(zhì)浸潤,且小鼠血脂水平升高。12、ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)組小鼠較ApoE~(-/-)組小鼠主動脈壁上粥樣硬化斑塊形成和脂質(zhì)浸潤減少,血脂水平降低,VEGFA、VEGFR2、vWF表達(dá)量降低,miR-140表達(dá)量增高,斑塊內(nèi)膠原纖維含量增高;13、相關(guān)性分析結(jié)果顯示TLR4與VEGFA表達(dá)量呈正相關(guān)性,miR-140與TLR4、VEGFA的表達(dá)量均為負(fù)相關(guān)性。結(jié)論:1、TLR4促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管新生。2、miR-140靶向負(fù)調(diào)控TLR4抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管新生。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54
【圖文】：

1.3.1 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)血管新生1.3.1.1 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的建立在本實驗中，分別用 5、10、20、30、50、100μM 濃度的 LPC 處理 HUVE-12細(xì)胞 24 小時后，LDH 試劑盒檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷情況，結(jié)果顯示，與 NC 組比較，在 30μM 濃度時細(xì)胞 LDH 釋放量開始呈濃度梯度升高而增高（NC:8.296±0.246，30μM:13.020±0.656，50μM:20.756±0.265，100μM:33.883±0.220，P＜0.05）（圖 1-1A）；CCK8 檢測細(xì)胞增殖活力，實驗結(jié)果顯示細(xì)胞增殖活力在30μM 濃度時開始呈濃度梯度升高而下降（NC: 6.456±0.4081，30μM:4.92±0.317，50μM:2.866±0.221，100μM:2.0967±0.198，P＜0.05）（圖 1-1B），在50μM 濃度后細(xì)胞增殖活力明顯受到抑制而不利于后續(xù)實驗的進(jìn)行，因此在本課題實驗中選用 30μM 濃度的 LPC 誘導(dǎo)損傷 HUVE-12 細(xì)胞，建立氧化應(yīng)激損傷模型細(xì)胞，此濃度也與本課題組前期實驗中的濃度一致。

碩士學(xué)位論文1.3.1.2 氧化應(yīng)激的 HUVE-12 細(xì)胞 TLR4、VEGFA 表達(dá)量增高，miR-140表達(dá)量降低（1） WB 檢測細(xì)胞 TLR4、VEGFA 蛋白的表達(dá)量上述結(jié)果中可得知氧化應(yīng)激狀態(tài)下可以促使 HUVE-12 細(xì)胞血管新生增強，為了進(jìn)一步研究其機制，我們首先用 WB 檢測了 TLR4 的表達(dá)量，結(jié)果顯示 LPC30μM 組較 NC 組 TLR4 的表達(dá)量明顯增高（NC: 157.333±5.033，LPC 30: 213±7.211，P＜0.05）；此外檢測 VEGFA 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示 LPC 30μM 組較 NC 組 VEGFA 表達(dá)量亦顯著增高（NC: 167±8.185，LPC 30: 217±5.567，P＜0.05）（圖 1-2）。

圖 1-3 IF 檢測氧化應(yīng)激的 HUVE-12 細(xì)胞內(nèi) VEGFA 蛋IF detection of oxidative stress in VEGFA protein expression of VEGFA protein in LPC 30μM group is increased, bin (Alexa Fluor594 fluorescent secondary antibody), 40X, scal group, P < 0.05.qPCR 檢測細(xì)胞 TLR4、VEGFAmRNA 的表達(dá)量和PCR 結(jié)果顯示，用 30μM LPC 誘導(dǎo)細(xì)胞氧應(yīng)激后，mRNA 的表達(dá)量升高（NC: 1，LPC 30: 2.95±0.03，P 組較 NC 組 VEGFA mRNA 的表達(dá)量亦升高（NC0.05）（圖 1-4B），LPC 30μM 組較 NC 組 miR-141，LPC 30: 0.38±0.03，P＜0.05）（圖 1-4C）。

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