【摘要】：目的:1、研究氧化應(yīng)激(Oxidative stress,OS)條件對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)及凋亡的作用。2、觀察OS條件下HUVECs中自噬及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的變化。3、探究自噬對(duì)OS條件下的內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)作用是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。方法:1、研究OS條件對(duì)HUVECs發(fā)生EndMT及增殖凋亡的作用。分組:Control組:正常條件(21%O_2,5%CO_2,74%N_2,37°C)下培養(yǎng)HUVECs;OS組:正常培養(yǎng)條件下用H_2O_2(200μM)處理HUVECs,相應(yīng)條件下培養(yǎng)的HUVECs于第5天進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):(1)用分光光度法檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量;(2)流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率;(3)光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;(4)免疫熒光雙標(biāo)染色,在熒光顯微鏡下觀察CD31、αSMA熒光強(qiáng)度變化及CD31~+/αSMA~+雙陽性細(xì)胞(表示同時(shí)具有內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞特性正在發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞),并計(jì)數(shù)分析;(5)用Western blot法測定各組細(xì)胞中CD31、αSMA、FSP-1蛋白含量的并做比較。2、研究OS條件下HUVECs中自噬及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的變化。實(shí)驗(yàn)分組:Control組:正常條件(21%O_2,5%CO_2,74%N_2,37°C)下培養(yǎng)HUVECs;OS組:H_2O_2(200μM)下培養(yǎng)HUVECs,兩組細(xì)胞分別于培養(yǎng)5天后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):用Western blot法測定各組細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路(Wnt3a,β-catenin,survivn)和自噬(P62,LC3-II,LC3-I,Beclin-1)相關(guān)蛋白含量并比較。3、探究自噬對(duì)OS條件下的內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)作用是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)分組(1)OS組:H_2O_2(200μM)條件培養(yǎng)HUVECs;(2)H_2O_2+雷帕霉素(Rapamycin,Rap)(100nm)組:HUVECs在H_2O_2(200μM)處理3天后加入雷帕霉素共同處理2天;(3)H_2O_2+6-氨基-3-甲基嘌呤(6-Amino-3-methylpurine,3MA)(5 mm)組:HUVECs在H_2O_2(200μM)處理3天后加入3MA共同處理2天;(4)H_2O_2+BIO-acetoxime(BIO)(1μM)組:HUVECs在H_2O_2(200μM)處理3天后加入BIO共同處理2天;(5)H_2O_2+XAV939(1μM)組:HUVECs在H_2O_2(200μM)處理3天后加入XAV939共同處理2天;(6)H_2O_2+Rap+BIO組:HUVECs在H_2O_2(200μM)處理3天后加入BIO處理1天然后加入Rap共處理2天;(7)H_2O_2+Rap+XAV939組:在H_2O_2(200μM)處理3天后加入XAV939處理1天然后加入Rap共處理2天;進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):(1)流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率;(2)用Western blot法測定各組細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白(Wnt3a,β-catenin,survivn)和自噬(P62,LC3-II,LC3-I,Beclin-1)相關(guān)蛋白含量的比較。(3)免疫熒光雙標(biāo)染色,在熒光顯微鏡下觀察CD31、αSMA強(qiáng)度變化及CD31~+/αSMA~+雙陽性細(xì)胞,并計(jì)數(shù)分析。結(jié)果:1、OS條件對(duì)HUVECs的EndMT及增殖凋亡的影響(1)分光光度法檢測氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)SOD活性及MAD含量結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,過氧化氫處理組SOD的活性明顯增加,MAD的含量明顯增加(P0.05)。(2)流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率顯示:與對(duì)照組比較,過氧化氫處理模擬氧化應(yīng)激條件促使細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P0.05)。(3)光學(xué)顯微鏡可見:與對(duì)照組比較,H_2O_2組HUVECs的形態(tài)逐漸趨向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài),呈現(xiàn)兩端常中間粗的紡錘形。(4)免疫雙標(biāo)熒光染色結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,H_2O_2組模擬氧化應(yīng)激條件促使HUVECs中可見明顯的α-SMA熒光信號(hào),且有CD31~+/αSMA~+雙陽性細(xì)胞。(5)Western Blot檢測顯示:OS條件促進(jìn)α-SMA、FSP-1蛋白表達(dá),抑制CD31蛋白的表達(dá)(P0.05)2、OS條件下HUVECs中自噬水平及Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)的變化(1)Western Blot檢測自噬及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,H_2O_2組HUVECs中P62、Beclin-1蛋白表達(dá)下調(diào),LC3-II/LC3-I、Wnt3a、β-catenin、survivn蛋白表達(dá)上調(diào)(P0.05)。3.調(diào)控自噬及Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)OS條件下的內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)作用探究(1)流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率顯示:與H_2O_2組比較,H_2O_2+Rap組細(xì)胞的凋亡率明顯下降(P0.05),而H_2O_2+3MA組的細(xì)胞凋亡率明顯升高;H_2O_2+BIO組細(xì)胞凋亡率較H_2O_2組下降,而較H_2O_2+Rap組細(xì)胞的凋亡率升高;H_2O_2+XAV939組細(xì)胞凋亡率較H_2O_2+BIO組明顯升高且高于H_2O_2組;H_2O_2+Rap+XAV939組細(xì)胞的凋亡率低于H_2O_2+XAV939組而高于H_2O_2+Rap組(P0.05)。(2)Western Blot檢測顯示:Rap促進(jìn)了OS條件誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin-1的表達(dá),抑制了OS條件誘導(dǎo)的EndMT相關(guān)蛋白及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt3a、β-catenin、α-SMA、FSP-1的表達(dá),3MA組則表現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢;與H_2O_2+Rap組比較,BIO促進(jìn)了OS誘導(dǎo)的End MT相關(guān)蛋白α-SMA、FSP-1的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)了OS條件誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt3a、β-catenin、survivn的表達(dá);Rap、Rap+BIO共同處理均抑制了OS條件誘導(dǎo)的EndMT相關(guān)蛋白α-SMA、FSP-1的表達(dá),Rap組抑制作用較Rap+BIO組弱(P0.05)。(3)免疫雙標(biāo)熒光染色結(jié)果顯示:與H_2O_2組相比,Rap、XAV939組中α-SMA強(qiáng)度減弱,CD31強(qiáng)度增強(qiáng),而3MA、BIO組則趨勢相反(P0.05);與BIO組相比,Rap+BIO組中α-SMA熒光強(qiáng)度減弱,CD31則趨勢相反(P0.05)。結(jié)論:1、OS條件促進(jìn)HUVECs發(fā)生EndMT及凋亡。2、OS條件激活HUVECs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)自噬的發(fā)生。3、自噬通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)OS條件下的HUVECs的功能。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.5
【圖文】：

提取培養(yǎng)原代細(xì)胞CD31的表達(dá)：免疫熒光染色，CD31（紅色）、核（DAPI，藍(lán)色）

光學(xué)顯微鏡下HUVECs的形態(tài)（A：100×B:200×）

圖 2 光學(xué)顯微鏡下 HUVECs 的形態(tài)（A：100× B:200×）。3.2 用 H2O2模擬 OS 損傷我們用 H2O2(200 μM)處理 HUVECs 模擬 OS 條件，用分光光度法檢測結(jié)示 H2O2(200 μM)處理的 HUVECs 中 SOD 活性明顯高于對(duì)照組（P<0.05），計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，按上述原理及方法檢測各組細(xì)胞中 MDA 的含量顯示，與組比較，H2O2(200 μM)處理的 HUVECs 中 MDA 含量明顯升高（P<0.05）統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖 3A,B），這提示我們用 H2O2(200 μM)處理 HUVECs 模S 條件是成功的。B

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本文編號(hào)：2777016