發(fā)布時間：2020-07-31 17:16

【摘要】：研究目的骨髓異常增生綜合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)是造血干細胞的惡性克隆性疾病,特點為無效造血、難治性血細胞減少,高危MDS會向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化。目前常根據(jù)國際預后評分系統(tǒng)(IPSS)來預測MDS向白血病轉(zhuǎn)化的風險,將MDS分為較低危(多為RCUD,RCMD)和較高危(多為RAEB)狀態(tài)。伴有原始細胞增多的高�；颊�,向白血病轉(zhuǎn)化的發(fā)生率高,常規(guī)化療效果差,緩解期短,易發(fā)生耐藥,一直是臨床面臨的難題。阿糖胞苷(Ara-C)作為嘧啶類抗代謝藥物,通過抑制細胞DNA的合成,干擾細胞的增殖,是治療高危MDS病人的傳統(tǒng)藥物。然而,MDS病人對阿糖胞苷的單藥治療的總反應率只有20%-30%。有文獻報道,NRF2與急性髓系白血病(AML),慢性髓系白血病(CML)和慢性淋系白血病(CLL)耐藥有關(guān)。在化學/氧化應激條件下,細胞中NRF2可逃離KEAP1的抑制,通過NRF2上Neh1域的一個核轉(zhuǎn)位信號進入胞核,啟動抗氧化反應元件(ARE)調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。NRF2的靶基因有:醌氧化還原酶-1(NQO1),血紅素加氧酶(HO-1)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶(GCL)等等。以上NRF2的靶基因能夠保護細胞應對各種有毒物質(zhì)引起的應激。目前仍未知NRF2是否能提示MDS患者的臨床預后,或者NRF2是否與MDS患者耐藥相關(guān)。研究方法1)對已發(fā)表的MDS患者的基因表達數(shù)據(jù)進行基因富集分析,并在MDS患者骨髓標本中進行免疫組化實驗,以探究MDS患者NRF2的表達情況,以及其對預后的影響。免疫組化染色評分采用積分半定量法。2)體外實驗以高危MDS細胞株SKM-1以及MDS小鼠模型細胞株Ml1PTD/WT/RUNX1-S291fs為主要研究對象,研究NRF2在MDS中的耐藥作用。利用慢病毒轉(zhuǎn)染,構(gòu)建NRF2以及DUSP1 shRNA的細胞株,并利用Western blot和Q-PCR驗證敲低是否成功;利用MTS、臺酚藍染色計數(shù)檢測MDS細胞活性和增殖情況,描繪細胞生長曲線和存活率曲線;通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和周期;通過尾靜脈注射NRF2 shRNA和scramble shRNA SKM-1細胞至NOD/SCID-IL2Rynull-SGM3(NSGS)小鼠,構(gòu)建MDS移植小鼠模型,進行后續(xù)體內(nèi)實驗。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)及Q-PCR驗證NRF2及DUSP1的關(guān)系。研究結(jié)果1)NRF2在高危MDS中表達升高,并與不良預后相關(guān)183例MDS患者的基因富集分析結(jié)果提示:與較低危MDS(RARS和RA)患者相關(guān),NRF2下游靶基因在較高危MDS患者(REAB-1/2)中顯著富集(P=0.020)。137例MDS患者的骨髓免疫組化結(jié)果提示,高危的MDS患者(IPSS-R評分為極高危、高危和中危)骨髓中NRF2的表達高于低�；颊�(IPSS-R評分為低危)(P=0.010)。預后生存分析結(jié)果顯示,NRF2表達水平較高的患者(IHC評分為4～6)總生存期(OS)比NRF2表達水平較低的患者(IHC評分為0～3)較短(中位生存期,391 天比 554 天,P=0.011)。2)敲低NRF2使MDS細胞系對阿糖胞苷的敏感性增加NRF2抑制劑木犀草素(Luteolin)與阿糖胞苷同時處理MDS細胞后可降低阿糖胞苷的IC50。而NRF2激動劑萊菔硫烷(Sulforaphane)可使MDS細胞對阿糖胞苷耐藥。NRF2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染MDS細胞可顯著降低細胞NRF2的表達水平。較高濃度阿糖胞苷處理時,NRF2 shRNA細胞的早期和晚期凋亡較scramble shRNA細胞顯著增加,同時更傾向于S期阻滯。3)NRF2通過其下游靶基因DUSP1調(diào)節(jié)MDS細胞對阿糖胞苷的耐藥我們分析了公開數(shù)據(jù)庫里的對阿糖胞苷敏感(IC506 μM)和耐藥(IC5080μM)的AML病人(共10例)的基因表達情況。發(fā)現(xiàn)有37個NRF2下游靶基因既在高危MDS病人中過表達,也在阿糖胞苷耐藥的AML病人中過表達。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)及q-PCR進一步驗證DUSP1是NRF2的下游靶基因。DUSP1的抑制劑BCI與阿糖胞苷在MDS細胞中有協(xié)同抑制作用。DUSP1的敲低能夠逆轉(zhuǎn)高NRF2引起的阿糖胞苷耐藥。以上結(jié)果提示,NRF2下游靶基因DUSP1是MDS細胞對阿糖胞苷耐藥的機制之一。在骨髓移植小鼠中,NRF2敲低的MDS小鼠肝臟腫瘤顯著減小(PBS處理組,2.30 g;阿糖胞苷處理組,1.77 g;P=0.010),DUSP1敲低的MDS小鼠肝臟腫瘤亦顯著減小(PBS處理組,1.84 g;阿糖胞苷處理組,1.41 g;P=0.001)。而在對照組小鼠中,肝臟腫瘤有減小的趨勢,但無顯著性差異(PBS處理組,1.91g;阿糖胞苷處理組,1.53g;P=0.052)。研究結(jié)論本文較系統(tǒng)地討論了 NRF2對MDS細胞阿糖胞苷耐藥的影響,并對其分子機制進行了初步探討。研究表明,NRF2表達水平在高危MDS患者中升高,并且提示不良預后。高NRF2表達水平的患者預后更差。NRF2抑制劑能使MDS細胞對阿糖胞苷反應性增加,而NRF2激動劑使其對阿糖胞苷耐藥。NRF2可通過下游基因DUSP1在MDS中調(diào)節(jié)耐藥作用。本研究顯示,敲低NRF2使MDS細胞對阿糖胞苷敏感;NRF2-DUSP1靶向治療與傳統(tǒng)化療的結(jié)合為將來高危MDS的治療帶來新希望。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R551.3
【圖文】：

浙江大學碩士學位論文邐正文實驗結(jié)果逡逑４實驗結(jié)果逡逑４．１邋ＮＲＦ２在高危ＭＤＳ患者中高表達逡逑為了觀察ＮＲＦ２在ＭＤＳ患者中的表達情況，我們在１３７例ＭＤＳ患者和１０例對照逡逑的骨髓標本進行ＮＲＦ２的免疫組化實驗。結(jié)果提示ＮＲＦ２在ＭＤＳ患者中表達增高逡逑（Ｐ＜０．０５，如圖４．１．１和圖４．１．２所示）�？ǚ綑z驗提示中危，高危及極高危組的ＭＤＳ逡逑患者的ＮＲＦ２水平顯著高于低危組的ＭＤＳ患者（（Ｐ＝０．００４，ｘ２＝邋８．１６３，如表４．１．１所示）逡逑

浙江大學碩士學位論文邐正文實驗結(jié)果逡逑４實驗結(jié)果逡逑４．１邋ＮＲＦ２在高危ＭＤＳ患者中高表達逡逑為了觀察ＮＲＦ２在ＭＤＳ患者中的表達情況，我們在１３７例ＭＤＳ患者和１０例對照逡逑的骨髓標本進行ＮＲＦ２的免疫組化實驗。結(jié)果提示ＮＲＦ２在ＭＤＳ患者中表達增高逡逑（Ｐ＜０．０５，如圖４．１．１和圖４．１．２所示）�？ǚ綑z驗提示中危，高危及極高危組的ＭＤＳ逡逑患者的ＮＲＦ２水平顯著高于低危組的ＭＤＳ患者（（Ｐ＝０．００４，ｘ２＝邋８．１６３，如表４．１．１所示）逡逑

表４．１．１不同ＩＰＳＳ－Ｒ組別的ＭＤＳ患者ＮＲＦ２表達水平的情況逡逑ＮＲＴ２免疫組化評￣￣ＮＲＦ２免疫組化評邋ｆ邐分為０－１邐分為２－６逡逑危組邐１２邐１７邐８Ｊ６３￣０００、高、極高危組邐１８邐９０逡逑利用公開數(shù)據(jù)庫，我們分析了邋１８３名ＭＤＳ患者和１７例健康對照的ＣＤ３４＋的胞。根據(jù)ＷＨＯ分型，所分析的ＭＤＳ患者分為ＲＡ（ｎ＝５５），ＲＡＲＳ（ｎ＝４８）ＡＢｌ（ｎ＝３７），ＲＥＡＢ２（ｎ＝４３）四類�；蚋患治鼋Y(jié)果提示：與健康對照相ＲＦ２下游靶基因在ＭＤＳ患者中無顯著性差異（圖４．１．３）。但與低危ＭＤＳ（ＲＡ／ＲＡＲＳ）相比，ＮＲＦ２下游靶基因在高危ＭＤＳ患者（ＲＥＡＢ１／２）中明顯富集．１．４）。逡逑

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本文編號：2776767