【摘要】：目的:動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發(fā)病率正在逐漸增高,研究AS及其相關疾病的發(fā)病機制和防治方法成為熱點。二氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)是5α-還原酶還原睪酮雙鍵形成的甾醇,是最具活性的雄激素。既往研究發(fā)現(xiàn),生理水平的DHT可以顯著減少巨噬細胞中血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor 1,LOX-1)的mRNA的表達,而且至少部分是通過雄激素受體(androgen receptor,AR)發(fā)揮作用的。為進一步探討雄激素及其受體對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用,本課題小組前期通過酵母雙雜交篩選出在男性外周血單核細胞內與AR相互作用的蛋白,得到核糖體蛋白L10(RPL10),前B細胞白血病同源框蛋白作用蛋白1(PBXIP1),但通過酵母雙雜交并不能充分證實蛋白與蛋白間的作用,存在假陽性的可能。為此,本實驗旨在利用pull down技術在體外對AR與上述蛋白的相互作用進行進一步驗證,進而探討在男性單核細胞中的蛋白與AR的相互作用的信號傳導通路,可能作為輔助調節(jié)因子與AR之間存在相互作用,為動脈粥樣硬化致病機制及治療方向提供理論依據(jù)和靶點。研究方法:本研究采用基因克隆的技術,將pGADT_7-RPL10、pGADT_7-PBXIP1作為模板,設計特異性引物,通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的片段。將RPL10、PBXIP1基因片段,克隆到利用Eco R I和Bam H I兩種限制性內切酶雙酶切后的含有GST標簽的pGEX_4T_2載體上,構建重組質粒pGEX_4T_2-RPL10與pGEX_4T_2-PBXIP1,進行測序并分析。利用誘導劑IPTG誘導大腸桿菌表達含有GST標簽的蛋白RPL10與PBXIP1,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,考馬斯亮藍染膠,脫色觀察蛋白表達情況。利用pull down技術,將pGBKT_7-AR重組質粒進行體外轉錄翻譯,作為捕獲蛋白;提取在大腸桿菌中表達的RPL10與PBXIP1蛋白,作為誘餌蛋白,將其固相化到MagneGST~TMM Particles上,將兩種蛋白共同孵育,洗脫,純化,利用Western blot技術分析相互作用的蛋白復合物,化學發(fā)光法鑒定結果并分析。結果:通過PCR技術獲得目的基因片段,并重組質粒GST-RPL10、GST-PBXIP1構建成功。IPTG誘導RPL10、PBXIP1融合蛋白成功表達后,用pull down和Western blot技術證實,GST-RPL10融合蛋白大小約在50KD左右,GST-PBXIP1融合蛋白大小約在52KD左右,空白對照GST蛋白大小約在26KD左右,AR-LBD融合蛋白大小約在37KD左右;兩種蛋白共同孵育后分別用不同抗體檢測可見GST-RPL10/PBXIP1融合蛋白在體外可以特異性的將c-myc-AR-LBD融合蛋白pull down下來,空白對照GST蛋白不能將c-myc-AR融合蛋白pull down下來。結論:通過Pull down技術進一步證實AR編碼蛋白分別與RPL10、PBXIP1在體外發(fā)生相互作用。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5
【圖文】：

20）將EP管放入磁力架中，行磁力捕獲，小心移除上清液，加入Magne GSTT結合/洗滌緩沖液 800ul，上下輕輕顛倒混勻。21）重復 20）步驟，一共進行 3 次洗滌。2、Western Blot 實驗步驟1）利用 SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒配制 12%分離膠和 5%濃縮膠。2）誘餌蛋白和捕獲蛋白復合體沉淀加入 1×SDS 上樣緩沖液 40ul，在 10pGBKT7- AR-LBD 捕獲蛋白、10ul 誘餌蛋白中，各加入 2×SDS 上樣緩沖液 10u混合均勻，放入水浴鍋中，煮沸 5min。14000g，5min，4℃離心。3）在加樣孔中分別加入捕獲蛋白、共同孵育后的蛋白、誘餌蛋白等，進行電泳至染色帶達邊緣，設置電壓：濃縮膠為 75V、分離膠為 130V。4）取出凝膠，量好尺寸，準備好大小相當?shù)?PVDF 膜、濾紙，將 PVDF 膜在甲醇中浸濕 5min，按照“陰極-海綿-濾紙-凝膠-膜-濾紙-海綿-陽極”，按下面的排序排好（圖 1）。

圖 2 目的片段 PCR 結果A:代表 RPL10 片段,條帶 1 大小與預期一致,測序分析,擴增成功,B:代表 PBXIP1 片段,條帶 2 為 PBXIP1 片段;大小與預期一致,測序分析,擴增成功3.1.2 重組質粒構建利用限制性內切酶 EcoR I 和 BamH I，對載體 pGEX4T2進行雙酶切，構建含有 GST 標簽的重組質粒 pGEX4T2-RPL10 、pGEX4T2-PBXIP1，PCR 鑒定片段大小與預期相符，經(jīng)測序分析，結果驗證重組質粒構建成功（圖 3）。A

圖 3 重組質粒的 PCR 鑒定結果A:代表重組質粒 pGEX4T2-RPL10,B:代表重組質粒 pGEX4T2-PBXIP1；條帶大小均與目的條帶大小相符，選取條帶 2，7 測序分析，重組質粒構建成功3.2 體外驗證 AR-LBD 編碼蛋白與 RPL10、PBXIP1 編碼蛋白間相互作用3.2.1 IPTG 誘導 RPL10、PBXIP1 表達蛋白將含有重組質粒 pGEX4T2- RPL10、pGEX4T2-PBXIP1 的大腸桿菌 DH5α中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 IPTG(終濃度 1mmol/L)，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，考馬斯亮藍 R250 染膠，脫色后觀察到 RPL10、PBXIP1 融合蛋白成功表達。3.2.2 體外驗證 AR-LBD 編碼蛋白與 RPL10、PBXIP1 編碼蛋白間相互作用

【參考文獻】

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本文編號：2775717