【摘要】：背景和目的:血管鈣化(Vascular calcification,VC)是一個與骨發(fā)育相似的主動的、高度可調(diào)的復雜病理生理過程,是冠狀動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變、血管損傷和慢性腎病等疾病中普遍存在的病理表現(xiàn),同時也是心血管疾病發(fā)病率和死亡率增加的重要危險因素之一。因此,積極開展改善VC的相關(guān)研究具有重大科學意義和社會價值。Klotho(KL)基因于1997年被發(fā)現(xiàn),作為一種抗衰老基因被廣泛研究。Klotho基因敲除鼠表現(xiàn)出一系列與人類早衰綜合征患者相似的表型,其中就包括VC。體內(nèi)實驗證實,使用基因整合技術(shù)或外源性補充重組蛋白的方式恢復Klotho敲基因鼠中Klotho的表達可顯著改善VC。而體外研究也發(fā)現(xiàn),Klotho重組蛋白可顯著減輕高磷誘導的小鼠主動脈平滑肌(Mouse aorta vascular smooth muscle,MOVAS)細胞的成骨樣分化(血管鈣化的重要起始環(huán)節(jié))。Klotho的抗鈣化的作用機制可歸結(jié)于兩方面。首先體內(nèi)KL的正常表達可以維持細胞外液的鈣磷平衡,其次Klotho還可以直接抑制細胞中的insulin/IGF-1信號通路和Wnt信號通路,而這些因素都是VC的重要致病因素。但是否還有其它機制參與,仍有待探究�？p隙連接(Gap junction,GJ)是細胞間直接通訊的重要組成部分。其由縫隙連接蛋白(Conexin,Cx)所構(gòu)成,作用是介導相鄰細胞間能量和物質(zhì)交換。在Cx家族中,Cx43是血管中表達最多的縫隙連接蛋白,且有報道指出,GJ介導的細胞間通訊對血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscles cells,VSMCs)的成骨樣分化有直接影響。所以,Cx43可通過介導VSMCs的成骨樣分化參與VC的發(fā)生。自噬是一種受刺激時,細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞器被降解的高度保守的病理生理過程,與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究證實,自噬起鈣化抑制作用,且自噬可以降解Cx43。但在血管鈣化模型中,Klotho與自噬的關(guān)系仍未可知。因此,本研究擬從體內(nèi)實驗入手,探究Klotho敲基因鼠中自噬和鈣化的改變,然后調(diào)控自噬,明確自噬的作用。然后在體外實驗中,驗證Klotho是否可以通過促進自噬抑制血管鈣化以及進一步明確自噬的作用;最后,結(jié)合體內(nèi)外實驗,探究Klotho是否可以通過促進自噬介導的Cx43降解抑制血管鈣化。方法:2.1 Klotho敲基因鼠基因型鑒定和VC檢測將Klotho雜合型(HZ)鼠合籠并繁殖后得到幼鼠,對幼鼠進行基因型鑒定后得到Klotho野生型(WT)和KL純合型(KO)鼠。5周齡雄鼠可用于實驗。取出Klotho敲基因鼠的主動脈,分別通過von kossa染色法檢測VC情況,鄰甲酚酞絡(luò)合酮(OCPC)法檢測小鼠主動脈中的鈣含量,免疫組化法檢測小鼠血管中Runx2的表達,q PCR實驗檢測鈣化相關(guān)分子Pit1、Pit2、Runx2和SM22 m RNA的表達,western blot法檢測Runx2和α-SMA蛋白的表達。2.2自噬在Klotho基因缺失導致血管鈣化中的作用2.2.1檢測Klotho基因敲除后,自噬的改變?nèi)〕鯧lotho敲基因鼠的主動脈,提取總蛋白,western blot實驗檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表達。血管行冰凍切片后,免疫熒光法觀察并統(tǒng)計組間小鼠血管中LC3點數(shù)和P62熒光的差異。2.2.2調(diào)控自噬后,觀察血管鈣化的變化分別給予WT、KO鼠腹腔內(nèi)注射適量的雷帕霉素(RA)和氯喹(CQ),2周后處死小鼠,取出主動脈,western blot實驗檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62、Runx2和α-SMA蛋白的表達,,OCPC法檢測小鼠主動脈的鈣含量。2.3小鼠主動脈平滑肌(MOVAS)細胞鑒定細胞免疫熒光實驗觀察Alexa-488標記的α-SMA在細胞中的表達。2.4 MOVAS細胞的鈣化誘導及鑒定將MOVAS細胞消化接種到6孔板中,實驗組使用鈣化培養(yǎng)液(Calcificaiton medium,CM)處理8-12天,對照組用普通培養(yǎng)液處理,每2天換液1次;分別使用茜素紅S染色觀察鈣沉積情況,OCPC法檢測MOVAS細胞中的鈣含量。2.5 Klotho重組蛋白對自噬及VC的作用2.5.1 Klotho重組蛋白對自噬的作用使用Klotho重組蛋白伴/不伴有氯喹(自噬抑制劑)處理MOVAS細胞,western blot實驗檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表達,雙熒光LC3腺病毒轉(zhuǎn)染MOVAS細胞后通過檢測組間紅點和黃點的差異來反映自噬流的改變。2.5.2 Klotho重組蛋白對血管鈣化的作用使用Klotho重組蛋白伴/不伴有氯喹(自噬抑制劑)處理MOVAS細胞,western blot實驗檢測Runx2和α-SMA蛋白的表達,茜素紅S染色實驗觀察鈣沉積情況,OCPC法檢測MOVAS細胞中的鈣含量。2.6 Klotho對Cx43的作用2.6.1 Klotho敲基因鼠中Cx43表達的變化Western blot實驗檢測Klotho敲基因小鼠主動脈Cx43蛋白的表達。2.6.2 Klotho敲基因鼠中Klotho調(diào)控自噬對Cx43的作用外源性腹腔內(nèi)給予Klotho重組蛋白伴/不伴有氯喹,western blot實驗檢測Cx43蛋白的表達。2.7體外實驗中,Klotho重組蛋白調(diào)控自噬對Cx43的作用體外實驗中,在Klotho重組蛋白的基礎(chǔ)上,使用Cx43的si RNA干擾Cx43的表達,western blot實驗檢測Runx2和α-SMA蛋白的表達,茜素紅S染色實驗觀察鈣沉積情況,OCPC法檢測MOVAS細胞中的鈣含量。結(jié)果:3.1 Klotho敲基因鼠表型及鑒定從形態(tài)學來看,KO鼠形態(tài)明顯小于WT和HZ鼠,有駝背,皮膚光澤度不佳。提取鼠尾DNA,PCR實驗后跑電泳并顯影。WT鼠只有野生型等位基因(458bp),KO鼠只有突變型等位基因(920bp),HZ鼠有兩種等位基因都有。3.2 Klotho敲基因鼠主動脈出現(xiàn)明顯血管鈣化Von kossa實驗結(jié)果顯示:與WT鼠相比,HZ鼠主動脈開始出現(xiàn)鈣化區(qū)域,KO鼠主動脈能觀察到更多、更明顯的鈣化區(qū)域。OCPC法檢測主動脈鈣含量,結(jié)果顯示:HZ組和KO組血管鈣含量均明顯高于WT組(p0.05,n=6),同時KO組血管鈣含量高于HZ組(p0.05,n=6)。免疫組化實驗檢測主動脈Runx2表達,結(jié)果顯示:Klotho基因被敲除后,Runx2的相對表達量逐漸增加(WT vs.HZ vs.KO;p0.05;n=6)。q PCR實驗檢測主動脈鈣化相關(guān)因子m RNA的表達,結(jié)果顯示:Klotho基因敲除后Pit1、Pit2及Runx2 m RNA的相對表達量均增加(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6),而SM22 m RNA的相對表達量降低(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6)。Western blot實驗檢測主動脈鈣化相關(guān)分子蛋白的表達,結(jié)果顯示:Klotho基因敲除后Runx2蛋白的相對表達量增加(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6),但α-SMA蛋白的相對表達量降低(WT vs.KO;p0.05,n=6)。3.3 Klotho基因被敲除后自噬上調(diào)Western blot實驗檢測Klotho敲除后小鼠主動脈自噬的改變,結(jié)果顯示:隨著Klotho基因的敲除,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相對表達量增加(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6),而P62蛋白的相對表達量降低(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6)。免疫熒光實驗檢測LC3和P62的表達,結(jié)果顯示:當Klotho基因被敲除后,LC3puncta/cell相對數(shù)量增加(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6),而P62的相對熒光強度逐漸降低(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6)。3.4在Klotho敲基因鼠體內(nèi)調(diào)控自噬,檢測鈣化的改變Western blot實驗檢測使用雷帕霉素促進自噬后鈣化的改變,結(jié)果顯示:使用雷帕霉素促進自噬,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相對表達量增加(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6)而P62蛋白的相對表達量降低(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6),鈣化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白的相對表達量降低(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6),而骨架蛋白α-SMA的相對表達量增加(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6)。Western blot實驗檢測使用氯喹抑制自噬后鈣化的改變,結(jié)果顯示:使用氯喹抑制自噬,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相對表達量增加(KO vs.KO+CQ;p0.05,n=6)同時P62蛋白的相對表達量也增加(KO vs.KO+CQ;p0.05,n=6),鈣化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白的相對表達量增加(KO vs.KO+CQ;p0.05,n=6),而骨架蛋白α-SMA的相對表達量降低(KO vs.KO+CQ;p0.05,n=6)。通過OCPC法檢測主動脈鈣含量,結(jié)果顯示:KO鼠腹腔注射雷帕霉素促進自噬后,主動脈鈣含量下降(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6),而給予氯喹抑制自噬后,主動脈鈣含量增加(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6)。3.5體外實驗中用Klotho重組蛋白處理細胞后,檢測鈣化及自噬首先通過細胞免疫熒光實驗鑒定所得細胞為MOVAS細胞株,并通過茜素紅S染色及鈣含量測定實驗證明細胞鈣誘導成功。Western blot實驗檢測給予Klotho重組蛋白處理后自噬的改變,結(jié)果顯示:鈣化誘導后,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相對表達量增加(WT vs.CM;p0.05,n=3),但P62蛋白的相對量降低(WT vs.CM;p0.05,n=3)。在鈣化誘導的基礎(chǔ)上,使用Klotho重組蛋白處理細胞,發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ/Ⅰ的相對表達量繼續(xù)增加(CM vs.CM+KL;p0.05,n=3),而P62蛋白的相對量繼續(xù)降低(CM vs.CM+KL;p0.05,n=3)。在Klotho重組蛋白基礎(chǔ)上再使用氯喹抑制自噬,則LC3-Ⅱ/Ⅰ的相對表達量進一步增加(CM+KL vs.CM+KL+CQ;p0.05,n=3),而P62蛋白的相對量升高(CM+KL vs.WT+KL+CQ;p0.05,n=3)。使用雙熒光LC3腺病毒轉(zhuǎn)染實驗檢測自噬流,結(jié)果顯示:鈣化誘導以后,自噬體數(shù)量(Control vs.CM;p0.01,n=3)和自噬溶酶體數(shù)量均增多(Control vs.CM;p0.01,n=3),說明自噬上調(diào)。鈣化誘導的基礎(chǔ)上,使用Klotho重組蛋白處理細胞,與CM組相比自噬體數(shù)量繼續(xù)增多(CM vs.CM+KL;p0.01,n=3),自噬溶酶體數(shù)量也繼續(xù)增多(CM vs.CM+KL;p0.01,n=3),說明自噬繼續(xù)上調(diào)。在鈣化誘導的基礎(chǔ)上,同時使用Klotho重組蛋白和自噬抑制劑氯喹時,自噬體數(shù)量進一步增多(CM+KL vs.CM+KL+CQ;p0.01,n=3),而自噬溶酶體數(shù)量降低(CM+KL vs.CM+KL+CQ;p0.01,n=3),說明自噬體和溶酶體的結(jié)合受阻,自噬被抑制。3.6體內(nèi)試驗中,Klotho可通過促進自噬抑制血管鈣化Western blot實驗檢測Klotho調(diào)控自噬對血管鈣化的影響,結(jié)果顯示:鈣化誘導后,Runx2蛋白的相對表達量增加(Control vs.CM;p0.05,n=3),而α-SMA蛋白的相對表達量降低(Control vs.in CM;p0.05,n=3)。使用Klotho重組蛋白處理細胞后,Runx2蛋白的相對表達量降低(CM vs.CM+KL;p0.05,n=3),而α-SMA蛋白的相對表達量恢復(in CM vs.CM+KL;p0.05,n=3),鈣化緩解。但在使用KL重組蛋白的基礎(chǔ)上用氯喹抑制自噬,Runx2蛋白的相對表達量再次回升(CM+KL vs.in CM+KL+CQ;p0.05,n=3),α-SMA蛋白的相對表達量再次降低(CM+KL vs.in CM+KL+CQ;p0.05,n=3),說明鈣化再次加重。茜素紅S染色和鈣含量測定實驗檢測Klotho調(diào)控自噬對血管鈣化的影響,從形態(tài)學來看,KL組相比于CM組的鈣沉積較少,而額外使用CQ抑制自噬,相比于KL組,KL+CQ組的鈣沉積又增多了。鈣含量檢測實驗結(jié)果顯示:使用Klotho重組蛋白處理細胞后,MOVAS細胞內(nèi)鈣含量降低(CM vs.CM+KL;p0.05,n=3),而用氯喹抑制自噬后,鈣含量再次增加(CM+KL vs.CM+KL+CQ;p0.05,n=3)。3.7 Klotho調(diào)控自噬對Cx43的影響Western blot實驗檢測Klotho敲基因鼠主動脈Cx43的表達,結(jié)果顯示:KO鼠主動脈Cx43蛋白的相對表達量高于WT鼠(p0.01,n=6),且KO鼠主動脈Cx43蛋白的相對表達量也高于HZ鼠(p0.01,n=6);Western blot實驗檢測Klotho重組蛋白對Cx43蛋白表達的影響,結(jié)果顯示:Klotho基因敲除后主動脈Cx43蛋白相對表達量增加(WT vs.in KO;p0.01,n=6),外源性給予Klotho重組蛋白后主動脈Cx43蛋白的相對表達量降低(KO vs.KO+KL;p0.05,n=6),在此基礎(chǔ)上使用氯喹抑制自噬,主動脈Cx43蛋白的相對表達量反而上升(KO+KL vs.KO+KL+CQ;p0.05,n=6)。3.8 Klotho調(diào)控自噬介導的Cx43降解對血管鈣化的影響Western blot實驗檢測Klotho調(diào)控自噬介導的Cx43降解對血管鈣化的影響,結(jié)果顯示:鈣化誘導后,Runx2蛋白的相對表達量增加(Control vs.CM;p0.01,n=3)而α-SMA蛋白的相對表達量降低(Control vs.CM;p0.01,n=3);使用Klotho重組蛋白處理細胞后,Runx2蛋白的相對表達量降低(CM vs.CM+KL;p0.01,n=3),α-SMA蛋白的相對表達量有一定恢復(CM vs.CM+KL;p0.05,n=3);在Klotho重組蛋白的基礎(chǔ)上,使用Cx43 si RNA干擾Cx43的表達,Runx2蛋白的相對表達量則又會降低(CM+KL vs.CM+KL+Si Cx43;p0.05,n=3),而α-SMA蛋白的相對表達量進一步恢復(CM+KL vs.CM+KL+Si Cx43;p0.05,n=3)。使用茜素紅S染色及鈣含量測定實驗檢測Klotho調(diào)控自噬介導的Cx43降解對血管鈣化的影響,茜素紅S染色結(jié)果顯示:鈣化誘導后,鈣沉積增多,使用Klotho重組蛋白處理MOVAS細胞后,細胞內(nèi)鈣沉積減少,而在Klotho重組蛋白的基礎(chǔ)上再用Cx43si RNA干擾Cx43的表達,則鈣沉積進一步減少。鈣含量檢測實驗中,鈣化誘導以后,MOVAS細胞中鈣含量明顯增多(Cotrol vs.CM;p0.01,n=3),使用Klotho重組蛋白處理細胞,細胞內(nèi)鈣含量減少(CM vs.CM+KL;p0.01,n=3),而在Klotho重組蛋白的基礎(chǔ)上再用Cx43 si RNA干擾Cx43的表達,則細胞內(nèi)鈣含量進一步減少(CM+KL vs.CM+KL+Si Cx43;p0.01,n=3)。結(jié)論:4.1 5周齡Klotho敲基因鼠主動脈出現(xiàn)明顯血管鈣化。4.2 Klotho敲基因鼠主動脈自噬上調(diào),且這種上調(diào)是一種保護性改變。4.3 Klotho可通過促進自噬抑制血管鈣化。4.4 Klotho可通過促進自噬介導的Cx43降解抑制血管鈣化。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R543
【圖文】：
32圖 1 Klotho 基因敲除鼠的表型比較Klotho 基因敲除鼠基因型鑒定生小鼠 3 周齡時，通過提取鼠尾 cDNA、PCR 擴增以及跑凝膠電泳等otho 基因敲除鼠的基因型。根據(jù)參考文獻可知，WT 鼠只有野生型），HZ 小鼠既有野生型等位基因（458bp）也有突變型等位基因（9有突變型等位基因（920bp）。電泳結(jié)果顯示（圖 2），編號①、②、③分別是 HZ、KO、HZ、KO。
圖 2 Klotho 敲除鼠基因型鑒定①、②、③、④指的是小鼠的編號，虛線提示其正上方為目標條帶所在2.4.2 Klotho 基因敲除鼠主動脈鈣化檢測（1）Klotho 基因敲除鼠 Von kossa 鈣化染色根據(jù)既往研究[15]，Von kossa 染色后，鈣化部位會被染成深褐色或棕黑色。分別選擇 WT、HZ、KO 鼠的主動脈切片進行 Von kossa 染色后，鏡下觀察并拍照。結(jié)果顯示：與 WT 鼠相比（圖 3A,B），HZ 鼠主動脈上能看到深染的鈣化區(qū)域（圖 3C,D）,而 KO 鼠主動脈能看到更加明顯、數(shù)量更多深染的鈣化區(qū)域（圖 3E,F）。
圖 2 Klotho 敲除鼠基因型鑒定①、②、③、④指的是小鼠的編號，虛線提示其正上方為目標條帶所在2.4.2 Klotho 基因敲除鼠主動脈鈣化檢測（1）Klotho 基因敲除鼠 Von kossa 鈣化染色根據(jù)既往研究[15]，Von kossa 染色后，鈣化部位會被染成深褐色或棕黑色。分別 WT、HZ、KO 鼠的主動脈切片進行 Von kossa 染色后，鏡下觀察并拍照。結(jié)果顯示 WT 鼠相比（圖 3A,B），HZ 鼠主動脈上能看到深染的鈣化區(qū)域（圖 3C,D）,而 KO動脈能看到更加明顯、數(shù)量更多深染的鈣化區(qū)域（圖 3E,F）。
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本文編號：2767630
