【摘要】：樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)是機(jī)體免疫系統(tǒng)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells,APC),能夠啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)。DCs是一類異質(zhì)性細(xì)胞群體,根據(jù)其分化狀態(tài)可分為成熟DCs和未成熟DCs。從表型上來看,成熟DCs高表達(dá)MHC-II類分子、CD80、CD86及CD83分子;未成熟DCs中這些分子的表達(dá)水平則相對(duì)較低。從功能上來看,成熟DCs具有強(qiáng)大的抗原提呈功能,不具備攝取功能;而未成熟DCs則具備較強(qiáng)的攝取功能,不具備抗原提成功能,且能夠誘導(dǎo)免疫耐受。有報(bào)道指出,在心肌缺血和病毒性心肌炎中,病灶內(nèi)有DCs浸潤。此外,DCs能夠調(diào)節(jié)炎性反應(yīng),參與心肌組織損傷的修復(fù)過程。已有文獻(xiàn)報(bào)道,DCs的成熟、分化及功能與其組蛋白乙酰化水平密切相關(guān)。曲古菌素A(Trichostatin A,TSA),是一種廣譜的組蛋白去乙酰化酶抑制劑(Histone deacetylase inhibitors,HDACIs)。我們前期工作證明,TSA能夠參與心肌組織修復(fù)過程,減小大鼠心肌梗死面積,減輕心肌損傷。在TSA促進(jìn)心肌組織損傷修復(fù)過程中,浸潤至心肌組織中的DCs數(shù)量明顯升高。但TSA對(duì)DCs有何作用,尚不十分明確。有研究表明,局部浸潤的DCs多為成熟DCs。因此,我們推測TSA能夠影響心梗后氧糖剝奪環(huán)境中DCs的成熟與功能。同大多數(shù)細(xì)胞一樣,在正常情況下,DCs通過氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)產(chǎn)生能量。有研究表明,DCs在缺氧條件下,會(huì)進(jìn)行代謝重編程,如糖酵解增強(qiáng)。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶之一。M1型丙酮酸激酶(PKM1)能夠促進(jìn)線粒體內(nèi)丙酮酸氧化生成乙酰輔酶A(Acetyl-CoA);而M2型丙酮酸激酶(PKM2)能夠促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)的表達(dá),誘導(dǎo)乳酸脫氫酶A(Lactic dehydrogenase A,Ldha)的產(chǎn)生,Ldha可以催化丙酮酸生成乳酸。此外,有報(bào)道指出,心肌缺血大鼠心臟中PKM2的表達(dá)增加,能夠改善大鼠心肌缺血損傷。因此,我們推測:在心肌缺血后氧糖剝奪環(huán)境中,TSA能夠通過影響DCs的糖酵解過程中PKM2的表達(dá),改變DCs的表型和功能,發(fā)揮心肌保護(hù)作用。研究目的:本研究將以小鼠dc2.4細(xì)胞系為研究對(duì)象,應(yīng)用體外氧糖剝奪條件,模擬心肌梗死后組織氧糖剝奪環(huán)境,觀察tsa對(duì)dc2.4細(xì)胞的表型與功能的影響,揭示心梗時(shí)tsa保護(hù)心肌的作用機(jī)制,從而為心肌缺血疾病的治療提供新的理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:以dc2.4細(xì)胞系為研究對(duì)象,通過mtt實(shí)驗(yàn)檢測氧糖剝奪條件下不同時(shí)間及不同tsa濃度作用的細(xì)胞存活率,分組包括:對(duì)照組(control組),單純?nèi)碧墙M(gd),單純?nèi)毖踅M(od)以及氧糖剝奪組(ogd);每個(gè)模型分別給予4個(gè)tsa給藥劑量:200nm、400nm、800nm、1000nm;時(shí)間設(shè)置為:24h,12h,8h以及4h,以確定氧糖剝奪時(shí)間、氣體條件以及tsa的工作濃度;采用流式細(xì)胞術(shù),檢測在確定的給藥濃度和給藥時(shí)間條件下,tsa對(duì)氧糖剝奪條件下dc2.4細(xì)胞表型的影響。以fitc-dextran作為dc2.4細(xì)胞攝取物,檢測tsa對(duì)氧糖剝奪條件下dc2.4細(xì)胞抗原攝取功能的影響;采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),觀察tsa對(duì)氧糖剝奪條件下dc2.4細(xì)胞遷移能力的影響;應(yīng)用elisa檢測試劑盒,檢測tsa對(duì)氧糖剝奪條件下dc2.4細(xì)胞上清液中il-1β、il-10、il-12和tgf-β細(xì)胞因子分泌的影響;采用atp和乳酸檢測試劑盒,檢測tsa對(duì)氧糖剝奪條件下dc2.4細(xì)胞產(chǎn)生atp和乳酸的含量的影響;采用western-blot技術(shù)檢測氧糖剝奪條件下dc2.4細(xì)胞中pkm1/pkm2以及上游剪接因子srsf3的表達(dá)情況;采用rt-qpcr的檢測方法,檢測tsa對(duì)氧糖剝奪條件下dc2.4細(xì)胞內(nèi)pkm1/pkm2和srsf3的mrna表達(dá)的影響,同時(shí)檢測tsa對(duì)糖酵解相關(guān)基因tpi1、hk2、ldha和hif-1α的mrna表達(dá)的影響;應(yīng)用shrna干擾srsf3和pkm2基因的表達(dá),檢測干擾srsf3后氧糖剝奪條件下dcs表達(dá)pkm2的情況,以及tsa對(duì)該條件下dcs產(chǎn)生atp和乳酸及分泌細(xì)胞因子的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)tsa對(duì)氧糖剝奪條件下dc2.4細(xì)胞的保護(hù)作用:mtt結(jié)果顯示:缺氧時(shí)間在8h及以上時(shí),細(xì)胞存活率過低,分別為8h:(32.03±1.04)%;12h:(12.19±3.35)%;24h:(8.56±2.29)%;因此,確定tsa在常氧、給藥時(shí)間低于12h時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率無影響后,確立ogd模型的缺氧時(shí)間為4h(存活率為:44.76±2.34%)。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)tsa200nm作用4h后,dcs存活率達(dá)到(70±3.11)%,因此,確定tsa給藥濃度為200nm。(2)tsa對(duì)dc2.4細(xì)胞成熟的影響:與control組相比,gd組、od組以及ogd組中cd80與cd86的表達(dá)有所升高;tsa200nm處理4h后,與各自的模型組相比,dc2.4細(xì)胞表面cd80與cd86表達(dá)明顯上升(p0.05)。(3)tsa對(duì)dc2.4細(xì)胞抗原攝取功能的影響:與control組相比,gd組、od組以及ogd組中fitc陽性率有所降低;而與各自的模型組相比,tsa處理(同上)后,dc2.4細(xì)胞的fitc陽性率顯著降低(p0.05)。(4)tsa對(duì)dc2.4細(xì)胞遷移的影響:與control組相比,gd組,od組以及ogd組遷移距離明顯減少;而與各自的模型組相比,tsa處理后,dc2.4細(xì)胞的遷移距離顯著增加(p0.05)。(5)tsa對(duì)dc2.4細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響:與各自模型組相比,control、gd以及od組,在tsa處理后il-1β,il-10、il-12和tgf-β四種細(xì)胞因子分泌均減少,ogd組在tsa處理后il-1β的分泌減少,il-10、il-12和tgf-β的分泌則增多(p0.05)。(6)tsa對(duì)dc2.4細(xì)胞中atp產(chǎn)生的影響:與control組相比,gd組與ogd組細(xì)胞上清液中atp含量明顯減少(p0.05),od組變化較小;與各自的模型組相比較,tsa處理后,細(xì)胞上清液中atp含量明顯增多(p0.05)。(7)tsa對(duì)dc2.4細(xì)胞中乳酸產(chǎn)生的影響:與control組相比,gd組、od組以及ogd組細(xì)胞上清液中乳酸含量均有所減少,ogd組乳酸含量減少更為顯著(p0.05);除control組以外,與各自的模型組相比較,tsa處理后,細(xì)胞上清液中乳酸含量均有增多,且gd組與ogd組給藥后,細(xì)胞上清液中乳酸顯著增多(p0.01)。(8)TSA對(duì)DC2.4細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響:給予TSA后,HIF-1α、Tpi1、HK2及Ldha的mRNA水平較之相應(yīng)的模型組顯著升高(P0.05)。(9)TSA對(duì)DC2.4細(xì)胞中PKM2、PKM1和SRSF3蛋白表達(dá)的影響:TSA處理后,PKM2與SRSF3蛋白表達(dá)較之相應(yīng)模型組顯著升高。而PKM1的表達(dá)則顯著下調(diào)(P0.05)。(10)TSA對(duì)DC2.4細(xì)胞中PKM2、PKM1、SRSF3 mRNA表達(dá)的影響:TSA處理后,PKM2與SRSF3的mRNA表達(dá)量較之相應(yīng)的模型組顯著增多,PKM1的mRNA表達(dá)量較之相應(yīng)的模型組顯著減少(P0.05)。(11)TSA對(duì)干擾SRSF3和PKM2后DC細(xì)胞產(chǎn)生ATP和乳酸含量的影響:干擾SRSF3和PKM2后,ATP和乳酸含量均減少(P0.05)。TSA處理后,與Vector組相比,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液中ATP和乳酸含量均顯著增加(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:(1)TSA能夠提高OGD條件下DC2.4細(xì)胞的存活率;(2)TSA能夠降低OGD條件下DC2.4細(xì)胞的抗原攝取能力、促進(jìn)DC2.4細(xì)胞成熟;(3)TSA能夠促進(jìn)OGD條件下DC2.4細(xì)胞的遷移、減少IL-1β的分泌、增加IL-10、IL-12和TGF-β的分泌。(4)TSA可能通過上調(diào)DC2.4細(xì)胞剪接因子SRSF3的表達(dá),促進(jìn)DC2.4細(xì)胞中PKM2的表達(dá),促進(jìn)糖酵解,增加ATP的產(chǎn)生,從而促進(jìn)DC2.4細(xì)胞存活,并且影響DC2.4細(xì)胞的成熟與功能。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2761945