發(fā)布時間：2020-07-18 13:19

【摘要】：目的和內(nèi)容:動脈粥樣硬化是一類常見的心血管疾病,由低密度脂蛋白滯留在血管易損部位引發(fā)的不良性炎癥反應(yīng)所致,參與炎癥反應(yīng)細(xì)胞主要涉及血管內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞、中膜平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞。但目前動脈粥樣硬化的治療手段有限,主要通過他汀類降血脂藥物加速低密度脂蛋白膽固醇的清除,如不加以控制,脂紋發(fā)展到后期形成易損斑塊,將大大增加心肌梗死的風(fēng)險,誘發(fā)心血管事件。飲食中富含的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)主要分為ω-6和ω-3 PUFA,其中花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)是ω-6 PUFA的代表,可以被環(huán)氧化酶途徑(cyclooxygenase,COX)、脂氧合酶途徑(lipoxygenase,LOX)或細(xì)胞色素P450途徑(cytochrome P450,P450)代謝生成小分子活性物質(zhì),有研究表明P450途徑的代謝產(chǎn)物環(huán)氧化二十碳三烯酸(epoxy-eicosatrienoic acid,EETs)具有抗炎和保護(hù)心血管作用,但是EETs在體內(nèi)能夠被可溶性表氧化物水解酶(Soluble epoxide hydrolase,sEH)水解,生成無保護(hù)作用的二羥二十碳三烯酸(Dihydroxy-eicosatrienoic acids,DHETs),所以抑制sEH酶活性有可能成為治療動脈粥樣硬化的新靶點。同樣ω-3 PUFA有著廣泛的心血管保護(hù)作用,而ω-3 PUFA也能經(jīng)ω-6 PUFA三條代謝途徑生成小分子活性物質(zhì),但這些代謝產(chǎn)物在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中的作用及機(jī)制還未被闡明,同樣有可能成為抗動脈粥樣硬化的靶點。方法和結(jié)果:第一部分我們主要觀察敲除sEH基因或藥物抑制酶活性后對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的影響。LDLR~(-/-)和LDLR~(-/-)-sEH~(-/-)小鼠為模型,以正常飲食(chow diet,CD)為對照組,處理組為西方飲食(western type diet,WTD),其中一組LDLR~(-/-)小鼠在WTD喂養(yǎng)同時給予sEH抑制劑tTUCB,6周后取材評價動脈粥樣硬化病情。我們發(fā)現(xiàn)基因敲除或藥物抑制sEH后顯著減少主動脈病灶面積,主動脈根部流出道斑塊面積及斑塊中巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)目減少,血脂水平得到改善。檢測血漿中EETs和DHETs濃度,發(fā)現(xiàn)基因敲除或藥物抑制sEH酶活性后,小鼠血漿中EET/DHET值增加。為進(jìn)一步探討EETs水平增加對巨噬細(xì)胞的影響,我們將LDLR~(-/-)和LDLR~(-/-)-sEH~(-/-)小鼠骨髓細(xì)胞移植到銫源照射過的LDLR~(-/-)小鼠體內(nèi),WTD喂養(yǎng)6周。我們發(fā)現(xiàn)移植LDLR~(-/-)-sEH~(-/-)骨髓細(xì)胞后,小鼠斑塊面積顯著減少,且通過熒光珠子標(biāo)記方法發(fā)現(xiàn)斑塊中Ly6C~(hi)單核細(xì)胞比例明顯減少,提示EETs對單核細(xì)胞的粘附功能可能有影響。體外實驗我們發(fā)現(xiàn)小鼠單核細(xì)胞中sEH被敲除或藥物抑制酶活性后可以增加細(xì)胞內(nèi)EET/DHET值,在轉(zhuǎn)錄水平上降低PSGL1的表達(dá),并減少PSGL1介導(dǎo)的粘附作用。第二部分我們研究ω-3 PUFA在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用。以LDLR~(-/-)為模型,WTD為對照組,處理組在WTD基礎(chǔ)上添加高純度深海魚油(WTD+ω-3)。由于高等哺乳動物不能將ω-6 PUFA轉(zhuǎn)化為ω-3 PUFA,而線蟲中存在一種脂肪酸去飽和酶fat-1,具有將ω-6 PUFA及其代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化稱ω-3PUFA及其代謝產(chǎn)物的功能,于是我們構(gòu)建線蟲fat-1基因與LDLR~(-/-)雜交小鼠(LDLR~(-/-)-fat-1~(tg)),觀察內(nèi)源性增加體內(nèi)ω-3 PUFA對動脈粥樣硬化的影響。WTD喂養(yǎng)6周后,我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充ω-3 PUFA或轉(zhuǎn)入fat-1轉(zhuǎn)基因都可以顯著減少WTD誘發(fā)的動脈粥樣硬化斑塊形成,增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性。實時定量PCR分析血管炎癥基因表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)ω-3 PUFA的增加能夠顯著抑制血管炎癥基因上調(diào),通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞激活,減少血中單核細(xì)胞浸潤到血管內(nèi)膜。進(jìn)一步我們采用UPLC-MS/MS分析小鼠現(xiàn)血漿中PUFA代謝譜,發(fā)現(xiàn)二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)的P450通路代謝產(chǎn)物18-羥化二十碳五烯酸(18-hydroxy-eicosapentaenoic acid,18-HEPE)和17,18-環(huán)氧化二十碳五烯酸(17,18-epoxy-eicosatetraenoic acid,17,18-EEQ)的水平在ω-3 PUFA補(bǔ)充組和fat-1轉(zhuǎn)基因組都顯著升高。在體外實驗中,18-HEPE和17,18-EEQ預(yù)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,能夠抑制NF-κB信號通路,降低腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα,TNFα)促發(fā)的炎癥基因表達(dá),同時能夠減少單核細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)論:在WTD誘導(dǎo)的LDLR~(-/-)小鼠模型中,基因敲除或藥物抑制sEH活性能夠增加小鼠體內(nèi)EETs水平,通過降低單核細(xì)胞中PSGL1基因的表達(dá),減少對血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的滾動和粘附,進(jìn)而緩解動脈粥樣硬化病情;同時我們也發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性或外源性增加小鼠體內(nèi)ω-3 PUFA水平能阻礙動脈粥樣硬化的發(fā)生,主要是依賴EPA P450通路的代謝產(chǎn)物18-HEPE和17,18-EEQ,使內(nèi)皮細(xì)胞的激活減少,緩解血管炎癥。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5
【圖文】：

士學(xué)位論文 實驗結(jié)果 sEH 在動脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制敲除或藥物抑制緩解動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)通過給予 LDLR-/-小鼠西方飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化，（tTUCB）的方法抑制小鼠 sEH 的酶活性，設(shè)置分予正常飲食、西方飲食或西方飲食+sEH 抑制劑（鼠給予正常飲食或西方飲食，喂養(yǎng) 6 周，實驗過程中

津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 結(jié)由于 LDLR-/-小鼠給予正常飲食喂養(yǎng)不會誘發(fā)動脈粥樣硬化，只有在 W件下才會誘發(fā)主動脈產(chǎn)生粥樣硬化，同時其主動脈根部瓣膜形成斑塊。通較 LDLR-/-CD 和 WTD 兩組，我們發(fā)現(xiàn) WTD 組主動脈病灶面積明顯增加，模型成功，同時敲除 sEH 基因或藥物抑制 sEH 活性可以緩解動脈粥樣硬化，減少主動脈病灶面積（圖 1.2）。

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 結(jié)果1.2 sEH 基因敲除或藥物抑制改善小鼠血脂水平由于血脂水平是誘發(fā)動脈粥樣硬化的主要因素，所以我們首先檢測小鼠血總膽固醇（triglyceride, TG）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotecholesterol, LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterHDL-C）。結(jié)果顯示，經(jīng) 6 周 WTD 飲食后，LDLR-/-小鼠的 TC 和 LDL-C 顯著高（圖 1.3A&B），HDL-C 水平顯著降低（圖 1.3 C）；而給予 sEH 抑制劑或基敲除 sEH 后能顯著抑制 WTD 誘發(fā)的血脂升高，同時升高 HDL-C 水平。

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本文編號：2760939