【摘要】：背景:心力衰竭的基本機制是心室重構(gòu)。心力衰竭不僅存在心室的結(jié)構(gòu)重構(gòu),還有離子通道分子水平的電重構(gòu),這種電重構(gòu)可能與心衰后心室顫動相關(guān)。心室的結(jié)構(gòu)重構(gòu)主要體現(xiàn)在心肌肥厚和心肌纖維化等方面。NLRP3炎癥小體是關(guān)鍵的炎癥反應(yīng)調(diào)控因子,其核心蛋白NLRP3與Caspase 1、ASC形成復(fù)合體能促進活化經(jīng)典炎癥分子IL-1β,同時也參與調(diào)控典型的促纖維化因子TGF-β。NLRP3能介導(dǎo)心肌細胞的炎癥聯(lián)級反應(yīng)、誘導(dǎo)心肌細胞焦亡和纖維化。但NLRP3影響Nav1.5的表達與否與具體機制皆有待研究。目的:建立心力衰竭模型后,誘發(fā)大鼠室顫,探究NLRP3和Nav1.5的表達是否有變化,在此基礎(chǔ)上,探討NLRP3炎癥小體通過IL-1β及TGF-β介導(dǎo)調(diào)控心肌細胞Nav1.5蛋白表達水平的機制。方法:1.大鼠隨機分手術(shù)組(腹主動脈縮窄術(shù))和假手術(shù)組,行大鼠心臟彩色超聲評價大鼠心功能。在建立心力衰竭模型的基礎(chǔ)上,經(jīng)食道電刺激誘發(fā)大鼠室顫,同等誘發(fā)條件刺激假手術(shù)組。取兩組大鼠左心室心肌組織行Western Blotting檢測Nav1.5和NLRP3核心蛋白的表達。2.利用vehicle、NLRP3-shRNA、IL-1β-shRNA、TGF-β-shRNA腺病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和兩種病毒共同轉(zhuǎn)染H9C2大鼠心肌細胞系,細胞分為6組:1)LV-shRNA組(轉(zhuǎn)染了vehicle的空載病毒,即對照組);2)NLRP3-shRNA組;3)IL-1β-shRNA組;4)TGF-β-shRNA組。此四組為單個病毒轉(zhuǎn)染組。5)NLRP3-IL-1β-shRNA組;6)NLRP3-TGF-β-shRNA組,此兩組為在成功轉(zhuǎn)染NLRP3病毒的基礎(chǔ)上再繼續(xù)轉(zhuǎn)染IL-1β或TGF-β病毒。RT-PCR及熒光標記蛋白表達觀測鑒定轉(zhuǎn)染情況。3.檢測6組細胞中的Nav1.5、NLRP3、IL-1β、TGF-β、ASC和Caspase 1蛋白表達水平,免疫熒光觀察LV-shRNA組和NLRP3-shRNA組中Nav1.5的分布和表達。探究NLRP3與TGF-β、IL-1β的關(guān)系以及各炎癥因子對Nav1.5的表達的影響。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS 21.0處理,Western Blotting灰度值選擇Adobe Photoshop CS6計算,小提琴圖和柱狀圖分別采用R 3.5和GraphPad Prism5制作。心臟超聲各指標用均數(shù)±標準差來表示,多組間連續(xù)性變量之間的比較采用單因素方差分析,兩組間的連續(xù)性變量則使用兩獨立樣本t檢驗。P0.05認為有統(tǒng)計學差異。結(jié)果:1.腹主動脈縮窄術(shù)8周后,心臟彩超顯示大鼠的左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率和心輸出量與假手術(shù)組相比明顯降低,暗示心衰大鼠模型構(gòu)建成功。12V的電壓刺激16秒,心力衰竭大鼠穩(wěn)定誘發(fā)心室顫動,同等條件下假手術(shù)組無心室顫動發(fā)生。室顫大鼠左心室心肌中NLRP3核心蛋白的表達比對照組高,反之,Nav1.5比對照組要低。2.一次轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率檢測:LV-shRNA組、NLRP3-shRNA組、IL-1β-shRNA組、TGF-β-shRNA組鏡下熒光顯示轉(zhuǎn)染成功。兩種病毒共轉(zhuǎn)組轉(zhuǎn)染效率檢測:經(jīng)RT-PCR檢測NLRP3-IL-1β-shRNA組中IL-1β和NLRP3-TGF-β-shRNA組中TGF-β的表達量,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,IL-1β和TGF-βmRNA表達量分別被抑制,且鏡下熒光蛋白表達良好,表明各組轉(zhuǎn)染成功。3.與LV-shRNA組相比,NLRP3-shRNA組、NLRP3-TGF-β-shRNA組和IL-1β-shRNA組的Nav1.5的表達量皆上調(diào)了,且NLRP3-TGF-β-shRNA組比NLRP3-shRNA組上調(diào)得更加明顯,而NLRP3-IL-1β-shRNA組并不上調(diào)。IL-1β-shRNA組是在所有沉默組中表達最高的,NLRP3沉默之后,使Nav1.5的蛋白含量增加的同時,伴隨著NLRP3、ASC、Caspase 1以及TGF-β和IL-1β等炎癥因子同期下調(diào)。IL-1β和TGF-β病毒轉(zhuǎn)染以后,NLRP3的蛋白含量反而升高,而NLRP3-TGF-β-shRNA組發(fā)生下調(diào)。各實驗組IL-1β、TGF-β表達比空載病毒組皆低,且各組中基本檢測不到成熟的TGF-β。IL-1β-shRNA組相較于NLRP3-IL-1β-shRNA組,NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1β、pro-IL-1β及pro-TGF-β的表達皆被抑制,Nav1.5則被促進。另外,ASC和Caspase 1在各組的表達時高時低、并不完全同步,無目前尚無明確規(guī)律可循,但ASC和Caspase 1分別在在NLRP3-TGF-β-shRNA組和NLRP3-shRNA組中表達最為積極,兩者在IL-1β沉默的組中下調(diào)最為明顯。4.免疫熒光顯示Nav1.5在NLRP3沉默組表達豐度明顯增加。結(jié)論:1.經(jīng)腹主動脈縮窄術(shù)8周后可成功構(gòu)建心力衰竭模型,12V的電壓經(jīng)食道刺激16秒可誘發(fā)心衰大鼠發(fā)生室顫。2.NLRP3、IL-1β、TGF-β皆參與對Nav1.5蛋白表達的調(diào)控,NLRP3可直接下調(diào)Nav1.5的表達。且NLRP3炎癥小體通過TGF-β介導(dǎo)抑制心肌細胞Nav1.5的表達水平,然則通過IL-1β的可能性比較小,但IL-1β對Nav1.5的直接阻遏作用十分明顯。3.ASC和Caspase 1在各組中蛋白表達水平與NLRP3趨勢不一致。NLRP3、IL-1β、TGF-β、Caspase 1、ASC炎癥因子之間相互影響。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541.6;R541.75
【圖文】：

心衰組和對照組誘發(fā)所需的電壓和時間不同，且同一組的各只大鼠之中有差異，心衰一般為12V，16秒，假手術(shù)組所需的電壓和時間都更低。圖1-2 室顫前后和刺激時心電圖波形Figure1-2.ECG monitoring waveform of before and after ventricular fibrillation as well as the stimulation.3.3 WB結(jié)果本實驗在心衰后室顫組和假手術(shù)非室顫組中進行了蛋白表達水平的研究，研究顯示，與對照組相比，NLRP3表達明顯增高（P<0.0001），而Nav1.5的表達明顯降低（P<0.0001）。條帶清晰完整具有統(tǒng)計學意義。

嘌呤霉素濃度篩選結(jié)果

心衰后室顫大鼠中 NLRP3 炎癥小體影響心肌細胞 Nav1.5 表達的機制研究 2019 屆碩士研究生學位論文3.2 細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最佳病毒 MOI如下圖所示（圖 2-2），摸索 H9C2 心肌細胞的最佳轉(zhuǎn)染 MOI，使用濃縮的腺病毒分別以 MOI=5, MOI=10, MOI=40 的梯度進行轉(zhuǎn)染，最佳感染劑量是細胞感染效率的 80％或更高。如圖所示，最終所需 MOI 值為 40。

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