【摘要】：研究目的:心力衰竭是各種心血管疾病導(dǎo)致心功能不全的一種綜合癥,嚴(yán)重威脅人類的健康。盡管近年來在心衰診療方面取得了一些進(jìn)展,但心衰仍然有較高的發(fā)病率和死亡率,因此研制新型心衰治療藥物具有重要意義。Corin是一種主要表達(dá)于心臟的跨膜絲氨酸蛋白酶,可將心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)前體轉(zhuǎn)化為ANP,發(fā)揮調(diào)節(jié)血壓、維持心臟形態(tài)、改善心功能的作用。我們課題組研究發(fā)現(xiàn),心衰患者血漿中Corin水平顯著降低,且Corin水平降低程度與心衰的嚴(yán)重程度相關(guān)。最近許多報道也表明,在急性心肌梗死、冠心病、心衰和中風(fēng)患者中,血漿可溶性Corin水平顯著低于正常人。這些研究提示Corin缺乏或功能缺陷可能參與心衰等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。在本研究中我們用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及生物化學(xué)方法,表達(dá)獲得大量的可溶性Corin蛋白,并利用小鼠心衰模型探討可溶性Corin對心衰的治療作用。研究方法:1.以pSEC-EKsolCorin質(zhì)粒為模板克隆EKsolCorin-V_5/His片段,插入至pMH3表達(dá)載體,用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,G418抗性篩選穩(wěn)定克隆株。2.收集含Corin的細(xì)胞表達(dá)上清,通過Ni柱親和層析純化并經(jīng)SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色及蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)鑒定蛋白純度。3.在體外,用腸激酶EK活化重組可溶性Corin蛋白,用Western blot檢測有無~40 kDa的Corin活化條帶,判斷Corin是否能夠被活化。4.將pro-ANP上清和活化的可溶性Corin 37°C孵育30 min后,刺激BHK細(xì)胞,通過Western blot以及cGMP ELISA試劑盒檢測pro-ANP是否被轉(zhuǎn)化為ANP,BHK細(xì)胞內(nèi)cGMP是否升高,判斷Corin在體外有無生物學(xué)功能。5.結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立小鼠心衰模型,術(shù)后1周采用心臟超聲技術(shù)對心衰小鼠進(jìn)行心功能評價,取小鼠心臟進(jìn)行HE、Masson染色觀察心肌組織結(jié)構(gòu)。6.用心衰小鼠評估可溶性Corin的療效。術(shù)后一周,給模型小鼠腹腔注射活化的可溶性Corin,心超監(jiān)測小鼠在術(shù)前1天、術(shù)后7、14、21、28天等不同時間點的心功能指標(biāo)。實驗結(jié)束后,用Masson染色對心臟進(jìn)行組織學(xué)分析。研究結(jié)果:1.構(gòu)建了可溶性Corin的真核表達(dá)載體pMH3-EKsolCorin,轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞獲得高效穩(wěn)定表達(dá)EKsolCorin的細(xì)胞株。2.鎳柱親和層析純化的重組蛋白EKsolCorin純度達(dá)90%。3.純化的EKsolCorin可被腸激酶激活。4.活化的可溶性Corin可將pro-ANP轉(zhuǎn)化為ANP,提示Corin在體外具有生物學(xué)功能。5.心臟超聲檢測顯示心梗模型組小鼠心室明顯擴(kuò)大,心室壁厚度明顯變薄,心室收縮功能與舒張功能均顯著下降(p0.001)。HE和Masson染色可見心梗模型組小鼠心臟有明顯的梗死區(qū)。6.與PBS組相比,活化的可溶性Corin治療心衰小鼠后,可顯著改善小鼠的心功能,心室收縮功能與舒張功能均顯著增加(p0.01)。結(jié)論:綜上所述,我們表達(dá)純化了可溶性Corin,并在體外進(jìn)行了蛋白純度及生物活性鑒定,最后運(yùn)用小鼠心梗模型研究活化的可溶性Corin對心衰小鼠的治療作用。研究結(jié)果顯示獲得的可溶性Corin具有生物學(xué)活性,能改善心衰小鼠的心功能,提示可溶性Corin可作為心衰治療的新策略。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R541.6
【圖文】：

Corin的蛋白結(jié)構(gòu)模式圖

Corin的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及活化過程

WTCorin和可溶性Corin在CHO細(xì)胞中的表達(dá)A：WTCorin蛋白模式圖；B：Westernblot檢測Corin蛋白在CHO細(xì)胞裂解液中的表達(dá)與活化；C：Westernblot檢測Corin蛋白在CHO細(xì)胞上清中的表達(dá)與活化

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本文編號：2755652