【摘要】：研究背景風(fēng)濕性心臟病(Rheumatic heart disease,RHD)是A組溶血性鏈球菌感染后風(fēng)濕熱引起的自身免疫性疾病。該疾病主要累及二尖瓣,表現(xiàn)為瓣膜狹窄和關(guān)閉不全。RHD在我國仍有較高的患病率,是導(dǎo)致慢性心力衰竭及致死的主要心血管疾病之一。在感染鏈球菌后長期的慢性疾病發(fā)展過程中,心臟瓣膜組織是如何發(fā)生病變從而導(dǎo)致RHD發(fā)生的,目前確切機(jī)制并不明確,研究其致病機(jī)制并進(jìn)一步尋找RHD的新干預(yù)靶點(diǎn)具有重要意義。研究目的構(gòu)建RHD組大鼠模型,檢測RHD大鼠及control組大鼠外泌體中miR-155的表達(dá)差異,檢測兩組瓣膜組織中磷酸鞘氨醇受體1(sphingosine1-phosphate receptor 1,S1PR1)的表達(dá)情況。初步探討兩組大鼠中循環(huán)外泌體miR-155和S1PR1表達(dá)差異,利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證S1PR1與miR-155靶標(biāo)的關(guān)系。研究方法:30只Lewis雌性大鼠隨機(jī)化分為RHD組和control組,每組各15只。構(gòu)建RHD大鼠模型:第1周,RHD組于足墊皮下注射0.2ml抗原Ⅰ(滅活GAS菌液:完全弗氏佐劑乳化劑=1:1)。給藥間隔周期為7天,于第2周、3周、4周、5周腹部皮下注射0.5ml抗原Ⅰ。control組在同樣時(shí)間點(diǎn)、同樣劑量、同樣部位注射無菌生理鹽水+完全弗氏佐劑乳化劑。從第6周開始,RHD組予腹部皮下注射0.5ml抗原Ⅱ(滅活GAS菌液),給藥間隔周期為7天,直至第28周造模結(jié)束,control組在同樣時(shí)間點(diǎn)、同樣劑量、同樣部位注射無菌生理鹽水。32周模型構(gòu)建結(jié)束。造模結(jié)束后大鼠行經(jīng)胸心臟彩超檢查,在不同的切面對比兩組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(EF%)值、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS%)值、E/A比值。造模結(jié)束后處死大鼠,大鼠血漿提取外泌體并鑒定其形態(tài),提取外泌體總RNA行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)檢測兩組大鼠血漿外泌體中miR-155的表達(dá)情況,部分大鼠心肌及二尖瓣瓣膜組織行HE染色、Masson染色,部分二尖瓣瓣膜組織行免疫蛋白印跡(Western blot,WB)、PCR檢測S1PR1的表達(dá)情況。同時(shí)利用生物信息學(xué)的方法在線預(yù)測miR-155與S1PR1的結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建含有結(jié)合位點(diǎn)的S1PR1的3'UTR突變型質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒與miR-155和miR-NC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過過表達(dá)miR-155后,檢測熒光素酶活性變化,定量反映miR-155對S1PR1的抑制作用。研究結(jié)果1、造模過程中,RHD組大鼠死亡2只,control組大鼠死亡0只;2、造模結(jié)束后RHD組大鼠EF%為55.06±6.56,control組大鼠EF%為77.80±5.97,P值0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;RHD組大鼠FS%為23.60±3.90,control組大鼠FS%為39.83±5.60,P值0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;RHD組大鼠E/A比值為0.72±0.12,control組E/A比值為1.56±0.18,P值0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、瓣膜組織HE染色結(jié)果示,RHD組中有3只大鼠存在心肌炎癥細(xì)胞浸潤;RHD組中有10只大鼠二尖瓣瓣膜組織存在慢性淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤,出現(xiàn)膠原蛋白增生、鈣鹽沉積及血管新生等現(xiàn)象。RHD組大鼠瓣膜炎比例占76.9%(10/13);control組二尖瓣瓣膜組織未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤。4、Masson染色結(jié)果示,control組染色呈現(xiàn)淡藍(lán)色,膠原纖維無明顯增生現(xiàn)象;RHD組染色明顯加深,膠原纖維增生明顯,排列紊亂。5、RHD大鼠循環(huán)外泌體中miR-155表達(dá)量較control組大鼠的表達(dá)量高,p0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6、在mRNA基因水平及蛋白水平,RHD組大鼠瓣膜組織中S1PR1表達(dá)量較control組均下降。7、與共轉(zhuǎn)染S1PR1-3'UTR和miR-NC組相比,共轉(zhuǎn)染S1PR1-3'UTR和miR-155組熒光素酶活性下降明顯,P0.05。研究結(jié)論RHD大鼠循環(huán)外泌體中的miR-155表達(dá)升高,瓣膜組織中S1PR1表達(dá)量下調(diào);miR-155可能靶向S1PR1表達(dá)參與RHD的發(fā)生發(fā)展過程。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R541.2
【圖文】：

外泌體 miR-155 調(diào)控 S1PR1 在風(fēng)濕性心臟病發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系研究 碩士學(xué)位實(shí)驗(yàn)結(jié)果模結(jié)果 一般情況RHD 組大鼠第一次足墊注射抗原抗原Ⅱ后，出現(xiàn)足部發(fā)紅腫脹，皮高，靈活性變差，活動量減少等現(xiàn)象。關(guān)節(jié)腫脹至第 4 周開始逐漸消 7 周完全消退，未留下關(guān)節(jié)畸形。造模過程中，大鼠死亡 2 只，造模時(shí)，余 13 只大鼠。control 組大鼠同樣出現(xiàn)足部發(fā)紅腫脹，注射部位皮溫增高，大鼠活減少，食欲、精神減退。足部紅腫于第 2 周開始逐漸消退，第 4 周完退，未留下關(guān)節(jié)畸形。造模結(jié)束時(shí)，余 15 只大鼠。b ca7w4w1w

圖 2-1 miR-155-5p 與 S1PR1 的 3' UTR 存在特異性結(jié)合的位點(diǎn)Figure 2-1 Regions where miR-155-5p specifically binds to the 3' UTR of S12.各組細(xì)胞間熒光素酶活性的變化表 2-1 各組 luciferase 相對表達(dá)量Table 1-1 Relative expression of luciferase in each group3. 將 UTR-NC 組量化為 1 后，比較在相同的 miRNA 的作實(shí)驗(yàn)分組 熒光素酶活性變化（x±S實(shí)驗(yàn)組 1 1.00±0.06實(shí)驗(yàn)組 2 1.13±0.07實(shí)驗(yàn)組 3 1.00±0.03實(shí)驗(yàn)組 4 0.88±0.07實(shí)驗(yàn)組 5 1.00±0.01實(shí)驗(yàn)組 6 1.29±0.03陽參 miRNA NC 組 1.00±0.03陽參 miRNA 0.49±0.01

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本文編號：2750555