【摘要】：目的:心肌缺血預(yù)適應(yīng)(Ischemic preconditioning,IPC)指的是長(zhǎng)時(shí)間缺血前,先對(duì)心肌進(jìn)行一至多次短暫性缺血,每次缺血后緊接著進(jìn)行短暫性再灌注。IPC可提高心肌抵抗長(zhǎng)時(shí)間缺血損傷的能力。本實(shí)驗(yàn)旨在探討心肌細(xì)胞IPC作用中,雌激素效應(yīng)環(huán)指蛋白(Estrogen responsive finger protein,Efp)是否與14-3-3η存在相互作用;上調(diào)或下調(diào)Efp表達(dá)水平對(duì)14-3-3η表達(dá)水平及其泛素化狀態(tài)的影響,以及對(duì)IPC保護(hù)作用的影響。期許對(duì)IPC保護(hù)作用機(jī)制有進(jìn)一步了解。方法:本實(shí)驗(yàn)采用H9c2心肌樣細(xì)胞,構(gòu)建缺氧預(yù)適應(yīng)(Anoxic preconditioning,APC)模型、缺氧復(fù)氧(Anoxic/Reoxygenation,A/R)損傷模型。采用AD-Efp、AD-EfpRNAi重組腺病毒載體感染H9c2細(xì)胞,上調(diào)、下調(diào)Efp表達(dá)水平;Efp、14-3-3η和ubiquitin(ub)蛋白表達(dá)水平采用免疫印跡(Western blotting)法檢測(cè);免疫共沉淀(Co-ip)法檢測(cè)Efp與14-3-3η是否存在相互作用,及上調(diào)或下調(diào)Efp表達(dá)水平對(duì)14-3-3η泛素化程度的影響;MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活率;分光光度法檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)活性;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(ROS)、線粒體膜電位穩(wěn)定性(Δψm)及細(xì)胞凋亡水平,用于評(píng)價(jià)上調(diào)或下調(diào)Efp表達(dá)水平對(duì)心肌細(xì)胞APC保護(hù)作用的影響。結(jié)果:1.Control組、A/R模型預(yù)處理組、APC模型預(yù)處理組H9c2心肌樣細(xì)胞蛋白裂解液與Efp或14-3-3η一抗孵育后可以檢測(cè)到14-3-3η或Efp蛋白印跡。2.與APC組比較,APC+AD-Efp組14-3-3η蛋白表達(dá)水平明顯下降(p0.01),APC+AD-Efp RNAi組14-3-3η蛋白表達(dá)水平明顯上升(p0.01);與APC+AD-Efp組,加入蛋白酶體抑制劑MG-132顯著上調(diào)14-3-3η蛋白表達(dá)水平(p0.01)。3.與APC+MG-132組比較,APC+AD-Efp+MG-132組14-3-3η蛋白泛素化程度顯著加強(qiáng)。4.與APC組比較,APC+AD-Efp組細(xì)胞存活率顯著下降,LDH活性顯著上調(diào),ROS生成量增多,線粒體膜電位(Δψm)穩(wěn)定性顯著下降,細(xì)胞凋亡水平明顯上升(p0.01);APC+AD-EfpRNAi組細(xì)胞存活率顯著上升,LDH活性顯著下調(diào),ROS生成量減少,Δψm穩(wěn)定性顯著上升,細(xì)胞凋亡水平明顯下降(p0.01)。結(jié)論:在H9c2心肌樣細(xì)胞中,Efp與14-3-3η存在相互作用。在H9c2心肌樣細(xì)胞APC保護(hù)作用中,Efp介導(dǎo)14-3-3η發(fā)生泛素化及降解;上調(diào)Efp表達(dá)水平APC保護(hù)作用減弱,下調(diào)Efp表達(dá)水平APC保護(hù)作用增強(qiáng),此作用結(jié)果可能與Efp對(duì)14-3-3η蛋白表達(dá)水平的影響有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R542.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2744055