發(fā)布時間：2020-07-05 10:34

【摘要】：研究背景及目的哺乳動物的心臟在壓力負荷增加的情況下會發(fā)生心肌肥厚,以適應(yīng)增加的工作負荷,持續(xù)的心肌肥厚會導致心臟功能失代償,隨后發(fā)生心衰。心肌肥厚的主要病理表現(xiàn)有心肌細胞肥大、心肌細胞外基質(zhì)重建、心肌間質(zhì)增殖等。心肌細胞蛋白合成增加,可導致心肌細胞體積增大,即心肌細胞肥大。研究證實,心肌細胞肥大的形成需要刺激信號、信號傳導、細胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活化以及心肌表型轉(zhuǎn)化等四個環(huán)節(jié),其最終效應(yīng)是心肌表型由“成熟型”向“胚胎型”轉(zhuǎn)化。對于心肌肥厚的機制已有諸多研究,但其具體發(fā)生機制仍未明確,因而尚沒有可以確切有效預防心肌肥厚的方法。目前研究證實,在心肌肥厚的過程中,一組通常在胎兒心臟發(fā)育過程中表達的基因被重新表達,參與了心肌肥厚的病理調(diào)控。組蛋白是真核生物染色質(zhì)的組成部分,組蛋白亞基的氨基端游離稱為組蛋白尾巴,組蛋白尾巴上的許多殘基可以被共價修飾,不同殘基的不同修飾可以產(chǎn)生各種不同的信號,由其他信號蛋白識別,從而可調(diào)控真核生物的基因表達,導致轉(zhuǎn)錄激活或基因沉默,進而產(chǎn)生多種生物學效應(yīng)。已有研究表明,組蛋白修飾與多種疾病的發(fā)病密切相關(guān)。如慢性腎臟病、腫瘤性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等,在心血管領(lǐng)域,組蛋白修飾也發(fā)揮了重要作用。PHD鋅指蛋白8(PHF8)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白去甲基化酶,可在體內(nèi)通過對組蛋白的賴氨酸殘基進行去甲基化修飾來調(diào)節(jié)基因的表達。PHF8是組蛋白去甲基化酶JmjC家族中的一個成員,JmjC家族成員在正常的個體發(fā)育、分化、內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)及多種疾病的發(fā)生發(fā)展中參與重要的調(diào)節(jié)作用。PHF8作為JmjC家族中的一員,它可以特異性去除抑制性組蛋白標記H4K20mel和H3K9mel/2,而結(jié)合活性組蛋白標志H3K4me3,在組蛋白修飾中發(fā)揮重要作用并參與發(fā)育調(diào)節(jié)及多種疾病的發(fā)生發(fā)展。但PHF8在心血管系統(tǒng)尤其心肌肥厚中的作用尚不明確。本課題將從體內(nèi)和體外兩個部分設(shè)計試驗,旨在探討PHF8在心肌肥厚發(fā)病中的作用,并初步探討其作用的分子生物學機制,從而為防治心肌肥厚尋找新的契機和治療靶點。材料與方法1.轉(zhuǎn)基因動物模型的建立：構(gòu)建心臟特異性人PHF8基因轉(zhuǎn)基因(PHF8-Tg)小鼠。2.心肌肥厚動物模型的建立：通過主動脈縮窄術(shù)(TAC)建立壓力負荷誘導的心肌肥厚小鼠模型。3.小鼠超聲心動圖：小鼠心臟超聲檢測小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能。4.細胞培養(yǎng)及模型建立：提取原代新生大鼠心肌細胞(NRMCs)并培養(yǎng),體外以苯腎上腺素(PE)等刺激誘導NRMCs發(fā)生肥大性生長反應(yīng)。5.細胞內(nèi)PHF8干預：采用腺病毒載體轉(zhuǎn)染的方式干預NRMCs中PHF8的表達.6.HE染色、麥胚凝集素染色、Masson染色：分別顯示心肌的大體結(jié)構(gòu)、心肌細胞大小及心肌纖維化程度。7.免疫印跡：用于在蛋白水平檢測組織和細胞中PHF8、ANP及相關(guān)信號通路蛋白的表達變化。8. RT-PCR:用于在基因水平檢測組織和細胞中PHF8、ANP、β-MHC、BNP及相關(guān)信號通路mRNA水平的變化。9.3H-亮氨酸摻入試驗：用于檢測心肌細胞中蛋白質(zhì)合成水平。10.熒光酶活性檢測：用于檢測心肌細胞中胚胎基因的啟動子活性。11.免疫熒光分析：用于檢測心肌細胞的大小。研究結(jié)果1.病理性心肌肥厚下調(diào)PHF8水平：在TAC手術(shù)后4周野生型C57BL/6小鼠的心肌中,PHF8的表達顯著下降,在PE刺激的肥大性生長的NRMCs中,我們得到了相似的結(jié)論。這些研究結(jié)果表明PHF8可能參與了心肌細胞病理性肥大的過程。2.PHF8過表達抑制壓力負荷下的心肌重構(gòu)：接受TAC術(shù)4周后,PHF8-Tg小鼠的心功能顯著優(yōu)于野生型(WT)小鼠,左心室纖維化面積相比WT小鼠顯著減小,纖維化標記物(COL1A1, COL3A1, CTGF, TGF β 1,纖連蛋白和α-SMA)和肥厚性胎兒基因(ANP, BNP, β-MHC, ACTAl和IL-6)的表達在PHF8-Tg小鼠也顯著下調(diào),這些結(jié)果表明,PHF8可抑制壓力負荷誘導的病理性心肌重構(gòu)。3.PHF8調(diào)節(jié)NRMCs肥厚性生長：PHF8過表達可抑制PE誘導的肥厚性胎兒基因表達并下調(diào)其啟動子活性,而PHF8敲除則促進PE誘導的肥厚性胎兒基因表達并上調(diào)其啟動子活性。研究結(jié)果表明,PHF8在體外負向調(diào)節(jié)心肌細胞肥大反應(yīng)。4.PHF8調(diào)節(jié)AKT-mTOR信號通路：PHF8過表達顯著降低TAC誘導的Akt和mTOR的磷酸化,這表明PHF8過表達阻斷TAC誘導的Akt-mTOR信號通路。敲除PHF8則促進了PE誘導的AKT-mTOR途徑的激活。5.雷帕霉素可修復PHF8表型缺失：我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素抑制PE誘導的NRCMs肥大性生長,也抑制PE誘導的ANP和β-MHC的蛋白質(zhì)合成和啟動子活化,并且PHF8敲除誘導的ANP和β-MHC蛋白質(zhì)合成和增生性基因表達的上調(diào)被完全阻斷。因此,雷帕霉素可修復PHF8表型缺陷。結(jié)論及意義1.PHF8能抑制壓力負荷下心肌重塑及心肌細胞肥大性生長；2.PHF8抑制心肌細胞肥大性生長的作用可能是通過AKT-mTOR信號通路實現(xiàn)的；3.PHF8可能起到類似雷帕霉素抗心肌肥厚的作用。4.在本實驗研究中,我們分別在體內(nèi)及體外水平研究了PHF8對心肌肥厚的抑制作用,并初步探討了其作用的分子生物學機制,以期為臨床防治心肌肥厚提供新的思路和治療靶點。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
【圖文】：

圖２屯、臟特異性ＰＨＦ８轉(zhuǎn)基因小鼠的生成。逡逑（Ａ）屯、臟特異性ＰＨＦ８轉(zhuǎn)基因小鼠的生成示意圖。逡逑（Ｂ）免疫印跡盈示野生型小鼠Ｗ及ＰＨＦ８轉(zhuǎn)基因小鼠ＰＨＦ８的表達量。逡逑似免疫印跡顯示Ｐ冊８轉(zhuǎn)基因小鼠屯、、肝、腦、腎Ｗ及骨骼肌中Ｐ冊８的表達量。逡逑化－巧Ｐ冊８轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠在外觀及屯、功能方面無顯著差異。ＨＷ，如逡逑臟重量；ＢＷ，體重；ＴＬ，腔骨長度。每組ｎ二１０。逡逑化）ＰＨＦ８過表達不影響肥厚相關(guān)基因的表達。每組ｎ二５。逡逑

邐／Ｖ＂邋／邋盧逡逑《邐＜ｆ逡逑補充圖５圖７的定量數(shù)據(jù)。（Ａ）圖７Ａ的定量數(shù)據(jù)，每組ｎ＝５。（Ｂ）圖７Ｂ的定量逡逑數(shù)據(jù)。結(jié)果來自３次獨立試驗。逡逑５１逡逑

【共引文獻】

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本文編號：2742484