發(fā)布時(shí)間：2020-07-04 05:37

【摘要】：研究背景:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由于冠狀動(dòng)脈的急性持續(xù)性缺血缺氧,進(jìn)一步引起心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死,是常見(jiàn)的心血管疾病,其發(fā)病率與致死率呈逐年上升趨勢(shì)。其中,心律失常是AMI常見(jiàn)的臨床表現(xiàn),而梗死后室性心律失常(ventricular arrhythmias,VAs),尤其是室性心動(dòng)過(guò)速(ventricular tachycardia,VT)、心室顫動(dòng)(ventricular fibrillation,VF),是 AMI患者死亡和致殘的最重要原因。因此,早期治療和預(yù)防梗死后VAs成為降低AMI患者死亡率的重要措施,而如何找到預(yù)防與治療AMI后心律失常的藥物作用靶點(diǎn)及開(kāi)發(fā)治療AMI后心律失常的相關(guān)藥物成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前,已得到廣泛認(rèn)同的AMI后心律失常發(fā)生的機(jī)制有:AMI后自主神經(jīng)重構(gòu)、心肌電生理重構(gòu)、心室重構(gòu),以及心梗后交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)的分布、密度以及活性的失衡。其中,外周交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)是AMI發(fā)生后最重要的病理生理學(xué)反應(yīng)與臨床特征。另有研究表明,中樞神經(jīng)系統(tǒng)也參與了交感神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)。而目前中樞發(fā)病機(jī)制的研究主要集中于中樞心血管調(diào)節(jié)區(qū),如下丘腦室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus,PVN)與延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medulla,RVLM),主要通過(guò)炎癥、氧化應(yīng)激等相關(guān)信號(hào)通路對(duì)AMI損傷起調(diào)控作用。其中,PVN是調(diào)節(jié)體液平衡和交感神經(jīng)興奮的重要中樞,可以通過(guò)感受腦室室周器腦脊液的變化和腦干區(qū)域壓力,血容量和化學(xué)信號(hào)的變化,對(duì)心血管功能進(jìn)行調(diào)節(jié),在交感神經(jīng)活動(dòng)調(diào)控中起重要作用,也被稱(chēng)為“交感流出道”。有關(guān)研究指出,在側(cè)腦室注入炎癥因子,能夠在一定程度上刺激交感神經(jīng)的興奮性,并且PVN炎癥因子表達(dá)的增高和交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)有很大的關(guān)系。因此,如果能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)找到調(diào)控外周交感神經(jīng)活動(dòng)的作用靶點(diǎn),勢(shì)必會(huì)為AMI后心律失常的臨床治療提供新的途徑。高遷移率族蛋白(High Mobility Group Protein,HMG)屬于非組DNA結(jié)合蛋白,廣泛分布于高等真核生物的細(xì)胞核內(nèi),包括HMGA、HMGB、HMGBN三個(gè)亞群;HMGB亞群中進(jìn)一步分為HMGB1、HMGB2、HMGB3其中,HMGB1的含量最多,因在進(jìn)化過(guò)程中其序列高度保守,幾乎存在于所有的真核細(xì)胞中,同源性高達(dá)99%,是唯一能夠被釋放到細(xì)胞外發(fā)揮其胞外生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。人類(lèi)的HMGBI基因位于13號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的1區(qū)2帶,其相對(duì)分子量為25KD,普遍分布于機(jī)體的各項(xiàng)器官,如肝臟,肺臟及脾臟等中均存在,除在肝、腦組織中主要存在于胞漿外,在大多數(shù)組織中存在于胞核。在正常生理情況下,HMGB1在細(xì)胞核內(nèi)與DNA的結(jié)合是松散的,但當(dāng)細(xì)胞受到機(jī)械損傷或壞死的時(shí)候,HMGB1易于從受損的細(xì)胞核內(nèi)釋放到細(xì)胞外,繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。由于HMGB1在炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,因此亦被認(rèn)為是機(jī)體壞死細(xì)胞發(fā)出的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路對(duì)于維持腦的正常生理活動(dòng)起著重要的作用,如基因的增殖、分化以及死亡等。目前在哺乳動(dòng)物中研究最多的MAPK通路是ERK1/2,JNKs及p38通路。有研究證明,在中樞PVN內(nèi),ERK 1/2信號(hào)通路在調(diào)節(jié)心肌梗死后心衰中交感神經(jīng)的活性起著重要作用。因此,我們推測(cè)在AMI發(fā)生后,中樞PVN內(nèi)可能存在HMGB1的表達(dá),并且通過(guò)對(duì)大鼠中樞PVN內(nèi)雙極套管植入后微量泵注射HMGB1抑制劑(抗-HMGB1-多克隆抗體,Anti-HMGB1 polyclonal antibody,以下簡(jiǎn)稱(chēng) Anti-HMGB1-Ab),觀察HMGB1對(duì)外周交感神經(jīng)活性的影響,更好地解釋HMGB1與心梗后心律失常的關(guān)系并探討其可能的信號(hào)傳導(dǎo)通路,為心肌梗死后心律失常的治療和預(yù)防提供理論支持與藥物研制的新靶點(diǎn)。研究目的:本課題以大鼠AMI模型為研究對(duì)象,采用中樞PVN內(nèi)雙極套管植入后微量泵給藥方式,研究AMI后中樞PVN內(nèi)HMGB1的表達(dá)及其對(duì)外周交感神經(jīng)活性的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。從形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)角度,觀察各組大鼠中樞PVN內(nèi)HMGB1及ERK蛋白的表達(dá)情況;從功能學(xué)角度,觀察各組大鼠外周交感神經(jīng)活性的改變,共同來(lái)證實(shí)在大鼠AMI發(fā)生后,中樞PVN內(nèi)可通過(guò)HMGB1表達(dá)的上調(diào)參與AMI后心律失常的調(diào)節(jié),而這一過(guò)程很可能是通過(guò)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑完成的。研究方法:1.大鼠中樞PVN雙極套管植入購(gòu)置的SD大鼠兩只一籠經(jīng)過(guò)7天的適應(yīng)期后,進(jìn)行中樞PVN內(nèi)雙極套管植入術(shù),通過(guò)一次性預(yù)埋導(dǎo)管,可解決后續(xù)多次給藥時(shí)的密封難題,導(dǎo)管密封性好,可有效防止藥液溢出流失從而造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差。2.大鼠AMI模型的建立與分組實(shí)驗(yàn)大鼠分為以下四組:I-空白對(duì)照組(Control組);II-假手術(shù)組(Sham組):大鼠開(kāi)胸后左冠狀動(dòng)脈前降支僅穿線不結(jié)扎;III-MI組:使用永久性結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制作AMI模型;其中MI組再分為MI+IgG組和MI+Anti-HMGB1-Ab 組(將 10ug 的 Anti-HMGB1-多克隆抗體稀釋到10ul 的 TBS(pH=7.4)緩沖液中,每次注射10ul,以0.5μL/min的速度微量泵注射,隔日注射一次,連續(xù)7天;MI+IgG組中IgG注射的計(jì)量及頻次同前)。3.大鼠AMI后第7天,在呼吸機(jī)支持下,用電刺激儀行程序性電刺激測(cè)定心律失常的誘發(fā)率及易感性評(píng)分。4.大鼠AMI后第7天,左腰腹部縱行切開(kāi),暴露腎臟,分離左側(cè)腎交感神經(jīng),用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄外周腎交感神經(jīng)活性。5.在體實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,經(jīng)中樞PVN內(nèi)雙側(cè)注射亞甲藍(lán),再將大鼠斷頭取腦,制作冰凍切片,確定中樞PVN置管是否成功。6.在體實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,即刻取下心臟,采集心臟組織進(jìn)行Masson染色檢測(cè)大鼠急性心肌梗死造模是否成功,同時(shí)測(cè)定大鼠心梗面積,心梗面積達(dá)30-50%的大鼠納入實(shí)驗(yàn)組。7.在體實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,分別抽取各組大鼠左心室內(nèi)血液,采用ELISA方法檢測(cè)血漿中NE濃度。8.采用免疫組化方法檢測(cè)各組大鼠中樞PVN內(nèi)HMGB1的表達(dá)。9.采用Western blot方法檢測(cè)各組大鼠中樞PVN內(nèi)HMGB1及ERK蛋白的表達(dá)情況。研究結(jié)果:初始實(shí)驗(yàn)的115只大鼠中,78只納入實(shí)驗(yàn)(其中31只在PVN置管及心梗模型制備中死亡,6只由于心梗面積低于30%未被納入實(shí)驗(yàn)),并隨機(jī)分為4組:Ⅰ組:Control 組(n=15);Ⅱ組:Sham 組(n=15);Ⅲ組:MI+IgG 組(n=26);Ⅳ組:MI+Anti-HMGB1-Ab 組(n=22)。1.我們參照Paxinos-Watson大鼠腦立體定位圖譜,根據(jù)中樞PVN位置參數(shù),通過(guò)大鼠腦立體定位儀定位準(zhǔn)確后,行中樞PVN內(nèi)雙極套管植入術(shù)。2.在AMI造模過(guò)程中觀察結(jié)扎線以下心肌顏色變暗,局部波動(dòng)減弱為標(biāo)準(zhǔn),心電監(jiān)護(hù)提示Ⅰ、Ⅱ、aVL、aVF等導(dǎo)聯(lián)至少兩個(gè)導(dǎo)聯(lián)ST段抬高0.2mv,提示心肌梗死造模成功。3.我們?cè)趯?duì)大鼠進(jìn)行了程序化電生理刺激后發(fā)現(xiàn),在電極放置過(guò)程中,未見(jiàn)大鼠自發(fā)VAs,在電生理研究中未見(jiàn)大鼠死亡。Control組與Sham組VAs發(fā)生率為 10.0%,明顯低于 MI+IgG 組(13/26,50%)和 MI+Anti-HMGB1-Ab 組(8/22,36.4%)。Control組與Sham組心律失常易感性評(píng)分接近0分,而MI+IgG組大鼠易感性評(píng)分為3.4±0.85分、MI+Anti-HMGB1-Ab組易感性評(píng)分為1.5±0.56分。以上結(jié)果表明MI后大鼠心律失常的誘發(fā)率、易感性指數(shù)均明顯增加,而經(jīng)中樞PVN內(nèi)給予Anti-HMGB1-Ab后可顯著改善MI后心律失常易感性。4.我們采用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄外周腎交感神經(jīng)活性,發(fā)現(xiàn)Control組與Sham組大鼠的RSNA水平相比并無(wú)顯著差異,而MI+IgG組與MI+Anti-HMGB1-Ab組RSNA的表達(dá)與基礎(chǔ)值相比均有一定的變化,且與MI+IgG組相比,MI+Anti-HMGB1-Ab 組的 RSNA 反應(yīng)明顯減低(0.06±0.01 uv.s vs0.11±0.01 uv.s,p0.05)。5.我們通過(guò)中樞PVN雙極置管經(jīng)微量泵注射亞甲藍(lán)后,制作腦組織冰凍切片,觀察并確定中樞PVN置管是成功的。6.我們采用Masson染色進(jìn)一步證實(shí)心肌梗死造模成功并評(píng)估梗死面積,結(jié)果顯示心肌細(xì)胞呈紅色,纖維組織呈藍(lán)色。7.我們又采用ELISA法測(cè)定各組大鼠血漿中去甲腎上腺素水平,發(fā)現(xiàn)MI+Anti-HMGB1-Ab組大鼠血漿中去甲腎上腺素水平雖高于Sham組(17.101±0.490 pg/mL vs 14.949±0.562 pg/mL,p0.001),但是也明顯低于 MI+IgG 組大鼠血漿中去甲腎上腺素水平(17.101±0.490 pg/mL vs 21.047±1.358 pg/mL,p0.001)。以上結(jié)果表明,抑制中樞PVN內(nèi)HMGB1的表達(dá)可降低MI后異常升高的外周交感神經(jīng)活性。8.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示Control組和Sham組大鼠中樞PVN內(nèi)HMGB 1很少出現(xiàn),與Control組和Sham組相比,MI+IgG組大鼠中樞PVN內(nèi)HMGB 1陽(yáng)性核的密度明顯增高。而MI+Anti-HMGB1-Ab組大鼠中樞PVN內(nèi)HMGB 1陽(yáng)性核密度明顯低于MI+IgG組。9.我們用Western Blot方法檢測(cè)中樞PVN內(nèi)HMGB1是否通過(guò)ERK信號(hào)通路參與調(diào)控MI后外周交感的激活。使用Image J軟件進(jìn)行WB條帶恢復(fù)分析,并用目的蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值進(jìn)行歸一化處理,結(jié)果顯示:MI+IgG組大鼠中樞PVN內(nèi)HMGB 1蛋白水平顯著高于Control組和Sham組(2.66±0.43 vs 0.77±0.12,p0.001;2.66±0.43 vs 1.08±0.23,p0.001),而 MI+Anti-HMGB1-Ab組大鼠中樞PVN內(nèi)HMGB 1蛋白水平明顯低于MI+IgG組(1.43±0.24vs 2.66±0.43,p0.001)。此外,我們還發(fā)現(xiàn)MI+IgG組大鼠中樞PVN內(nèi)p-ERK的蛋白水平明顯高于 Control 組和 Sham 組大鼠(1.81±0.45 vs 0.77±0.22,p0.001;1.81±0.45 vs 0.93±0.23,p0.001)。而經(jīng) Anti-HMGB1-Ab 治療組大鼠中樞 PVN 內(nèi) p-ERK 蛋白的表達(dá)較MI+IgG組明顯降低(1.30±0.23 vs 1.81±0.45,p0.001)。以上結(jié)果表明,AMI后可導(dǎo)致中樞PVN內(nèi)HMGB1蛋白表達(dá)上調(diào)及ERK信號(hào)通路的激活,而給予HMGB1抑制劑Anti-HMGB1-Ab后,ERK信號(hào)通路的表達(dá)水平顯著降低,說(shuō)明中樞PVN內(nèi)HMGB1對(duì)外周交感神經(jīng)活性的調(diào)控是通過(guò)ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路完成的。研究結(jié)論:1.結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支制備AMI模型,可使AMI后大鼠中樞PVN內(nèi)HMGB1的表達(dá)上調(diào),并伴隨著外周交感神經(jīng)活性的增強(qiáng)和室性心律失常易感性的增加。2.在AMI發(fā)生后,經(jīng)中樞PVN內(nèi)微量泵注入Anti-HMGB 1-Ab,可以降低中樞PVN內(nèi)HMGB1的表達(dá),同時(shí)降低外周交感神經(jīng)活性和室性心律失常易感性,為AMI后室性心律失常的防治提供新的治療靶點(diǎn)。3.大鼠AMI后,中樞PVN內(nèi)HMGB1對(duì)外周交感神經(jīng)活性的影響可能是通過(guò)ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路完成的。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R542.22
【圖文】：

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑發(fā)率、易感性等方面的評(píng)分，以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式體現(xiàn)其狀況，ＭＩ＋ＩｇＧ組逡逑與假手術(shù)組相比，＊Ｐ＜0．邋０５；邋ＭＩ＋ＩｇＧ邋組與邋ＭＩ＋Ａｎｔｉ－ＨＭＧＢｌ－Ａｂ邋組相比，＃Ｐ＜０．邋０５。逡逑圖５．邋ＡＭＩ后腎交感活性測(cè)定逡逑

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