【摘要】：心血管疾病是一種臨床常見的疾病類型,許多心血管疾病都伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生,如心肌炎、擴(kuò)張型心肌病、急性心梗、心力衰竭等等。誘發(fā)炎癥的常見致病菌是革蘭氏陰性菌(G-),如大腸桿菌,其產(chǎn)生的內(nèi)毒素--LPS(脂多糖)是引起機(jī)體炎癥反應(yīng)的主要致病成分,當(dāng)其在血液中大量堆積時(shí)會(huì)形成內(nèi)毒素血癥,最終誘發(fā)多器官功能衰竭。近年來,內(nèi)毒素對于心臟方面的損害逐漸引發(fā)諸多研究學(xué)者的關(guān)注。HAX-1(HS1-associated protein X-1,HS1相關(guān)蛋白X-1)是一種新型的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白,有研究發(fā)現(xiàn),某些疾病(如:光化性角化病)炎癥反應(yīng)過程中,細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的合成表達(dá)增加,而抗凋亡蛋白HAX-1呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。但是,對于心肌細(xì)胞炎癥損傷過程中,HAX-1可能起到的作用以及其作用機(jī)制還沒有相關(guān)的研究報(bào)道。HAX-1作為一種新型的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白,其在心肌細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá),是發(fā)揮心肌保護(hù)作用的抗凋亡蛋白之一。因此,我們推測HAX-1可能在LPS誘導(dǎo)的心肌炎癥損傷過程中起到一定的作用。本課題以實(shí)驗(yàn)室自主分離獲取的乳鼠心肌細(xì)胞(Neonatal Rat Cardiac Myocytes,NRCMs)作為研究對象,采用脂多糖(LPS)處理乳鼠心肌細(xì)胞建立心肌細(xì)胞炎癥損傷模型,通過HAX-1腺病毒轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞內(nèi)HAX-1的表達(dá)量,探索HAX-1對心肌細(xì)胞炎癥損傷的影響以及可能的作用機(jī)制,以期能夠獲得治療心肌炎癥損傷的新思路。目的:研究抗凋亡蛋白HAX-1對乳鼠心肌細(xì)胞炎癥損傷的影響。方法:1.選取出生1-3天的SD大鼠新生乳鼠,體外分離、培養(yǎng)NRCMs,并用抗α-SMA抗體通過免疫熒光法對NRCMS進(jìn)行鑒定;2.LPS處理乳鼠心肌細(xì)胞,運(yùn)用MTT、Q-PCR法設(shè)計(jì)并建立心肌細(xì)胞體外炎癥損傷模型,并通過Western Blot法檢測NRCMs炎癥損傷時(shí)細(xì)胞內(nèi)HAX-1蛋白的表達(dá)情況;3.構(gòu)建可在心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的HAX-1腺病毒載體,并轉(zhuǎn)染進(jìn)入乳鼠心肌細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)HAX-1蛋白表達(dá)水平相應(yīng)的上調(diào)或者下調(diào),然后用LPS處理NRCMs建立體外炎癥損傷模型,通過Q-PCR、Western Blot法研究探索HAX-1對LPS所致心肌細(xì)胞炎癥損傷的影響,以及其可能的作用機(jī)制。結(jié)果:1.成功分離并培養(yǎng)鑒定乳鼠心肌細(xì)胞NRCMs。本實(shí)驗(yàn)采用一種有效而實(shí)用的NRCMs分離培養(yǎng)的方法,得到生長狀態(tài)良好,分離純度達(dá)到90%以上的心肌細(xì)胞,能夠保證實(shí)驗(yàn)研究的科學(xué)性,嚴(yán)謹(jǐn)性,準(zhǔn)確性;2.LPS誘導(dǎo)的NRCMs炎癥損傷模型中,NF-κB炎癥信號(hào)通路激活,細(xì)胞內(nèi)炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與正常組相比增加5倍(IL-1β)和9倍(IL-6),HAX-1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。結(jié)果表明,HAX-1可能在LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞炎癥損傷中具有一定的作用;3.HAX-1過表達(dá)時(shí),與GFP模型組相比,NRCMs內(nèi)相關(guān)炎癥因子m RNA水平的合成表達(dá)減少約30%,NF-κB炎癥信號(hào)通路中IκBα蛋白表達(dá)量增加30%左右,磷酸化蛋白表達(dá)量(P-p65、P-IκBα)下調(diào)約25%。結(jié)果表明,HAX-1可能通過抑制IκBα蛋白的磷酸化降解,進(jìn)而抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路的活化,減少下游蛋白的表達(dá),下調(diào)心肌細(xì)胞炎癥因子m RNA水平的表達(dá),在NRCMs炎癥損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。結(jié)論:乳鼠心肌細(xì)胞NRCMs炎癥損傷中,HAX-1通過抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα表達(dá)水平的下調(diào),以及降低p65、IκBα蛋白的磷酸化,進(jìn)而抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活,下調(diào)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄合成表達(dá),從而降低心肌細(xì)胞炎癥損傷,發(fā)揮保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R54
【圖文】：

圖 2.4.1 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征（100×）2.4.2 乳鼠心肌細(xì)胞 NRCMs 的免疫熒光鑒定乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng) 4d 后，用抗 α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的一抗經(jīng)由免疫熒光法對心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，如圖 2.4.2，可見抗 α-SMA 抗體特異性染色的紅色熒光，以及 DAPI 特異性細(xì)胞核染色藍(lán)色熒光，細(xì)胞計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的純度能夠達(dá)到 90%以上，完全可以滿足后續(xù)科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的需要。

2.4.1 乳鼠心肌細(xì)胞 NRCMs 的形態(tài)學(xué)特征倒置顯微鏡下觀察，可見剛分離出的乳鼠心肌細(xì)胞分散均勻多呈球形或橢球型，且存在部分細(xì)胞膜不光滑的異常形態(tài)細(xì)胞及碎片；培養(yǎng)24h后（如圖2.4.1），鏡下觀察細(xì)胞已基本貼壁完全且均勻分布，細(xì)胞密度較大時(shí)，可明顯觀察到貼壁細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)的搏動(dòng)，但搏動(dòng)的頻率和節(jié)律不一樣；繼續(xù)培養(yǎng) 2-3d，細(xì)胞逐漸生出偽足相互接觸，最終相互交聯(lián)形成密集的細(xì)胞簇，呈放射狀，細(xì)胞的自發(fā)搏動(dòng)強(qiáng)烈并且具有一定的節(jié)律性、傳導(dǎo)性。

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