【摘要】：目的:1、探討GLP-1對Ang Ⅱ所誘導的血管平滑肌細胞增殖及遷移的影響;2、進一步探究GLP-1對血管平滑肌細胞增殖及遷移的影響的分子機制。方法:1.細胞培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(rat aorta smooth muscle cells,RASMCs)在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基中生長,置于含5%CO_2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中,每1~2天更換培養(yǎng)基,取處于對數(shù)生長期的細胞用于下一步實驗。2.細胞增殖測定將RASMCs(1×10~4個/mL)接種于96孔板,邊緣孔使用PBS填充;5%CO_2 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞單層鋪滿96孔板孔底的90%;之后更換無血清培養(yǎng)基再分別加入不同的濃度的藥物:GLP-1、exendin-4、Ang Ⅱ、forskolin、H89、Y-27632濃度分別為20nM、10nM、100 nM、10μM、10μM、10μM,藥物處理24h后每孔加入20μL MTT溶液,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,棄去培養(yǎng)液后再向每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO),將96孔板置于搖床上低速震蕩10min,利用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔570nm處的吸光值,每個實驗組設(shè)置6個復孔,測定并計算均值,統(tǒng)計學分析比較各組細胞增殖率變化情況。3.細胞遷移測定將RASMCs接種于6孔板,待細胞長至90%融合后,用200μL規(guī)格的移液槍槍頭(黃色)進行細胞表面劃痕,使用PBS去除懸浮細胞后更換無血清培養(yǎng)基,再分別加入不同濃度的干預組藥物(分組及藥物干預濃度同上),藥物干預前及24h后利用尼康倒置顯微鏡觀察拍照后,使用尼康圖像分析軟件測量劃痕寬度,統(tǒng)計學分析各組細胞遷移率。4.Western blot檢測以RIPA裂解液提取細胞蛋白,使用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。在40μg蛋白的溶液中加入五分之一體積的5×蛋白Loading buffer,100℃金屬浴5min,上樣。電泳,轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2h,加入不同稀釋比例的一抗,在4℃孵育過夜(RhoA及ROCK2稀釋比例為1:200,p-MLC/MLC/β-actin稀釋比例為1:1000),1×TBST緩沖液漂洗后,分別加入HRP標記的山羊抗兔(或鼠)二抗(稀釋比例1:10000),室溫孵育2h后,進行顯影曝光。使用Image J軟件掃描各條帶灰度值,進行統(tǒng)計學分析。5.統(tǒng)計方法使用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學分析及作圖,實驗數(shù)據(jù)以mean±SD表示,多組間比較采用One-way ANOVA和方差齊性檢驗,兩組間兩兩比較采用t檢驗,若P0.05則認為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1.GLP-1抑制Ang Ⅱ誘導的RASMCs增殖MTT法檢測RASMCs細胞增殖能力,結(jié)果顯示GLP-1單獨處理對細胞增殖無影響,利用Ang Ⅱ處理細胞后,增殖能力與對照組相比明顯升高(P0.05),進一步利用GLP-1干預后,RASMCs增殖能力顯著降低,呈現(xiàn)藥物濃度依賴性,其中20nmol/L GLP-1處理效果最佳。揭示GLP-1對Ang Ⅱ所誘導的RASMCs增殖的抑制作用呈濃度依賴性。在檢測周期蛋白cyclinD1表達時觀察到,GLP-1可以降低Ang Ⅱ引起的RASMCs中cyclinD1的表達升高(P0.05),致使細胞增殖被抑制,與MTT結(jié)果一致。2.GLP-1抑制Ang Ⅱ誘導的RASMCs遷移細胞劃痕實驗檢測RASMCs細胞在不同處理條件下的遷移能力,結(jié)果顯示:與對照組相比,Ang Ⅱ組的細胞遷移水平提高(P0.05),而加入GLP-1干預后明顯抑制了Ang Ⅱ所誘導的細胞遷移能力(P0.05)。通過對MLC磷酸化水平的分析發(fā)現(xiàn),GLP-1降低了RASMCs中Ang Ⅱ引起的MLC磷酸化水平的升高(P0.05)。3.GLP-1抑制Ang Ⅱ誘導的RhoA及ROCK2表達Ang Ⅱ處理RASMCs 24h后,Western blot檢測RASMCs中RhoA及ROCK2的表達水平后發(fā)現(xiàn)二者均較對照組升高(P0.05),當加入GLP-1干預后,RhoA及ROCK2的表達受到抑制(P0.05),隨著GLP-1濃度的不斷升高,抑制作用也逐漸增強;給予GLP-1受體激動劑exendin-4及cAMP激動劑forskolin作用于GLP-1一致;但是同時給予PKA抑制劑H89時,RhoA/ROCK2表達相比Ang Ⅱ+GLP-1組顯著升高(P0.05)。以上結(jié)果說明,在RASMCs中GLP-1可能是通過cAMP/PKA調(diào)控RhoA/ROCK2信號通路。4.GLP-1通過cAMP/PKA/RhoA/ROCK2信號通路抑制Ang Ⅱ誘導的RASMCs增殖為了進一步驗證cAMP/PKA/RhoA/ROCK2信號轉(zhuǎn)導通路在GLP-1抑制Ang Ⅱ誘導的RASMCs增殖中所發(fā)揮的作用,我們再次通過MTT及cyclinD1的表達變化檢測對增殖的影響。結(jié)果顯示,與Ang Ⅱ單獨干預組相比,在其基礎(chǔ)上分別加入GLP-1、exendin-4、forskolin或ROCK2抑制劑Y-27632都能不同程度的抑制Ang Ⅱ誘導的細胞增殖(P0.05);加入H89后,GLP-1的作用受到明顯抑制,細胞增殖率再次升高(P0.05);同時給予GLP-1及Y-27632干預后與單獨給予GLP-1相比,增殖率進一步降低(P0.05)。Western blot檢測cyclinD1蛋白表達變化與增殖檢測結(jié)果一致,GLP-1、exendin-4、forskolin都能不同程度抑制Ang Ⅱ誘導的cyclinD1表達升高(P0.05),加入H89后GLP-1、exendin-4作用均減弱,與Ang Ⅱ+GLP-1組、Ang Ⅱ+exendin-4組相比,加入H89組的cyclinD1的表達水平升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);Y-27632也可抑制Ang Ⅱ引起的RASMCs中cyclinD1表達升高(P0.05);同時加入GLP-1與Y-27632后,較單一給予GLP-1組cyclinD1表達進一步下調(diào)(P0.05)。5.GLP-1通過cAMP/PKA/RhoA/ROCK2信號通路抑制Ang Ⅱ誘導的RASMCs遷移通過細胞劃痕實驗觀察到,加入GLP-1、exendin-4、forskolin或Y-27632都能不同程度的抑制Ang Ⅱ誘導的細胞遷移(P0.05);當加入H89干預后,GLP-1、exendin-4對Ang Ⅱ誘導的RASMCs遷移的抑制作用發(fā)生逆轉(zhuǎn),細胞遷移變化明顯(P0.05);同時發(fā)現(xiàn),Y-27632也能抑制Ang Ⅱ誘導的細胞遷移,同時給予GLP-1及Y-27632干預后與單獨給予GLP-1相比,細胞遷移得到進一步抑制(P0.05);通過對MLC磷酸化水平檢測發(fā)現(xiàn),加入H89干預后,GLP-1、exendin-4對Ang Ⅱ誘導MLC磷酸化的抑制作用減弱,MLC磷酸化水平升高(P0.05);Y-27632可以抑制Ang Ⅱ誘導的MLC磷酸化(P0.05);當GLP-1與Y-27632同時干預RASMCs后,MLC的磷酸化水平進一步下降(P0.05)。結(jié)論:GLP-1能通過cAMP/PKA/RhoA/ROCK2信號轉(zhuǎn)導通路抑制Ang Ⅱ誘導的RASMCs增殖及遷移。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R54
【圖文】：

2.1 Ang II 促進的血管平滑肌細胞增殖AngII作為RAAS中關(guān)鍵因子，在心血管系統(tǒng)中的作用至關(guān)重要，許多研究都證實其能有效的誘導血管平滑肌細胞的增殖。我們利用AngII從不同的干預時間（圖1-1A）及濃度（圖1-1B）發(fā)現(xiàn)，促進血管平滑肌細胞增殖最明顯的干預濃度為10-7mol/L（P＜0.05），干預時間為24h（P＜0.05），之后的實驗研究采用同樣的干預時間及濃度。圖1-1：Ang II促進血管平滑肌細胞增殖A.不同的Ang II干預時間對血管平滑肌細胞增殖的影響；B. 不同的Ang II干預濃度對血管平滑肌細胞增殖的影響；*P＜0.05 vs 0h組或Ang II 0mol/L組。Fig.1-1 Ang II promoted RASMCs proliferationA. The effects of different Ang II intervention time on RASMCs proliferation; B. The effects of differentAng II Intervention Concentrations on RASMCs Proliferation. Data are presented as means ±SD (*P＜0.05 vs Time 0h or Ang II 0mol/L).

2.2 GLP-1 抑制 Ang II 誘導的血管平滑肌細胞增殖為了排除GLP-1本身對血管平滑肌細胞增殖的可能影響，我們使用了不同濃度的GLP-1單獨處理細胞，結(jié)果顯示GLP-1本身對細胞增殖無影響（圖1-2 A）。同時，MTT法檢測細胞增殖結(jié)果顯示，利用AngII處理細胞后，增殖能力與對照組相比明顯升高，進一步利用GLP-1干預后（圖1-2B），血管平滑肌細胞增殖能力顯著降低，呈現(xiàn)藥物濃度依賴性，其中20nmol/L GLP-1處理效果最佳（P＜0.05）。揭示GLP-1對Ang II所誘導的血管平滑肌細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。圖1-2：GLP-1抑制Ang II誘導的血管平滑肌細胞增殖A.不同的GLP-1濃度單獨干預后對血管平滑肌細胞增殖的影響；B. 不同的GLP-1干預濃度對AngII誘導的血管平滑肌細胞增殖的影響；*P < 0.05 vs. control組, # P < 0.05 vs. Ang II組。Fig.1-2 GLP-1 inhibited Ang II-induced proliferation in RASMCsA. The effect of various concentrations of GLP-1 (5, 10, 20, and 30 nM) on RASMC proliferation. Cellproliferation was determined using the MTT assay. B. The effect of GLP-1 (5, 10, and 20 nM) on Ang II-induced RASMC proliferation. Cell proliferation was determined using the MTT assay. Data arepresented as means ±SD (*P < 0.05 vs. control, # P < 0.05 vs. Ang II).2.3 GLP-1 抑制 Ang II 所誘導 cyclinD1 表達CyclinD1是一種普遍存在于真核細胞中的周期蛋白，通過與周期蛋白依賴性激酶

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本文編號：2724595