【摘要】：心臟性猝死(sudden cardiac death,SCD)是由于心臟無法有效泵血而導(dǎo)致的一種急性癥狀,其特征包括意識喪失和呼吸驟停,如果不及時(shí)治療,最終會引起死亡。嚴(yán)重的室性心律失常(ventricular arrhythmia,VA)是心臟性猝死最主要的原因之一。大量離子通道分布在心肌細(xì)胞膜,快激活延遲整流鉀電流(the rapid component of IK,IKr)在維持心肌動(dòng)作電位的平臺期和3期復(fù)極期階段起重要作用,HERG(human ether-a-go-go-related gene)基因編碼IKr的α亞單位,HERG基因突變會引起心臟IKr電流減少,產(chǎn)生與7號常染色體有關(guān)的先天性長QT綜合征(long QT sydrome 2,LQTS-2)。LQTS通常與各種室性心律失常相關(guān),特別是尖端扭轉(zhuǎn)性室速(torsades de piontes,TDP)。具有高發(fā)心臟性猝死的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)可通過抑制IKr電流實(shí)現(xiàn)對HERG通道的急性調(diào)節(jié)。然而,和急性調(diào)節(jié)不同,慢性調(diào)節(jié)發(fā)生于數(shù)小時(shí)或更晚時(shí)間,常涉及蛋白基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。相關(guān)文獻(xiàn)指出,在異源表達(dá)系統(tǒng)或心肌細(xì)胞中,長時(shí)間激活PKA可使HERG通道蛋白表達(dá)量明顯增加,其中PKA直接磷酸化HERG通道蛋白在這一過程中起到了一定的作用。A型激酶錨定蛋白(A-kinase anchoring protein,AKAP)是一組功能上相關(guān)而結(jié)構(gòu)上不同的蛋白質(zhì),所有AKAP都能結(jié)合PKA。除此之外,AKAP還能與多種信號分子結(jié)合,構(gòu)成信號復(fù)合物,靶向特定的區(qū)域,從而實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的功能。心肌細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)有十幾種AKAP,在心肌肥厚,心律失常,心肌缺血,心力衰竭等疾病中都觀察到AKAP的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的改變,提示其在心臟的病理進(jìn)程中起著重要的作用。AKAP5是一種廣泛表達(dá)的錨定蛋白,可以與PKA,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,Ca N),鈣調(diào)蛋白(calmodulin,Ca M)和其他信號分子相互作用,但AKAP5是否能通過結(jié)合PKA慢性調(diào)節(jié)HERG通道目前仍不清楚。因此,本研究擬在異源表達(dá)系統(tǒng)上,采用分子生物學(xué),基因干預(yù)等技術(shù)研究AKAP5對HERG通道的慢性調(diào)節(jié)作用并初步探索其機(jī)制。本研究的完成給未來LQTS提供新的防治靶標(biāo),可以有效的預(yù)防心臟性猝死,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。第一部分:表達(dá)HERG通道蛋白和AKAP5錨定蛋白的細(xì)胞株的建立和鑒定目的:建立能單獨(dú)表達(dá)HERG鉀通道蛋白和AKAP5錨定蛋白與能同時(shí)表達(dá)上述兩個(gè)蛋白的HEK293細(xì)胞株。方法:用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將HERG基因和AKAP5基因分別轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞株上,HERG基因和AKAP5基因的轉(zhuǎn)染情況由瓊脂糖凝膠PCR鑒定,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞HERG蛋白和AKAP5蛋白的表達(dá)情況由Western blot檢測。結(jié)果:瓊脂糖凝膠PCR結(jié)果顯示AKAP5和HERG質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中能正常表達(dá),Western blot結(jié)果顯示AKAP5錨定蛋白和HERG鉀通道蛋白能正常表達(dá)。結(jié)論:成功建立了能單獨(dú)表達(dá)HERG和AKAP5與同時(shí)表達(dá)上述兩個(gè)蛋白的HEK293細(xì)胞株。第二部分:AKAP5對HERG鉀通道蛋白的慢性調(diào)節(jié)作用目的:在不同濃度或不同處理時(shí)間下對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞應(yīng)用PKA激動(dòng)劑forskolin,觀察AKAP5錨定蛋白的存在是否能影響到HERG鉀通道蛋白的表達(dá)。方法:將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分為只表達(dá)HERG的HEK293-HERG組和同時(shí)表達(dá)HERG和AKAP5的HEK293-HERG+AKAP5組,在不同濃度或不同處理時(shí)間下應(yīng)用PKA激動(dòng)劑forskolin孵育該兩組細(xì)胞后,Western Blot檢測HERG蛋白的表達(dá)量。結(jié)果:對HEK293-HERG和HEK293-HERG+AKAP5兩組細(xì)胞應(yīng)用PKA激動(dòng)劑forskolin 1μm、10μm、1000μm 24小時(shí)或應(yīng)用forskolin 10μm 6h、12h、24h后都可使HERG的表達(dá)量明顯上升。HEK293-HERG+AKAP5組相較于HEK293-HERG組,HERG的表達(dá)量的增加更為明顯。結(jié)論:AKAP5參與PKA對HERG鉀通道蛋白的慢性調(diào)控作用。第三部分:AKAP5對HERG鉀通道蛋白慢性調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制探討目的:在細(xì)胞水平闡明AKAP5對HERG鉀通道蛋白慢性調(diào)節(jié)的分子機(jī)制,即AKAP5可能通過特異性錨定和激活PKA慢性調(diào)節(jié)HERG鉀通道。方法:應(yīng)用免疫熒光和免疫共沉淀檢測HERG,AKAP5和PKA的結(jié)合和共定位。結(jié)果:免疫熒光和免疫共沉淀顯示,HERG和PKA,AKAP5相互結(jié)合并共定位于細(xì)胞膜上。結(jié)論:AKAP5可能通過特異性錨定和激活PKA直接磷酸化HERG鉀通道蛋白慢性調(diào)節(jié)HERG鉀通道。
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R541
【圖文】：

皖南醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文結(jié) 果1 HEK293 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁生長，有少量細(xì)胞代謝物，總體上細(xì)胞形態(tài)完整，胞質(zhì)中央存在圓形細(xì)胞核，形態(tài)清楚，反光良好，細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密，相互銜接。A B

圖 2：轉(zhuǎn)染后各組 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng)圖片（100×）。C 和 D：轉(zhuǎn)染后 HEK293-HERG 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)圖片。E 和 F：轉(zhuǎn)染后 HEK293-AKAP5 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)圖片。G 和 H：轉(zhuǎn)染后HEK293-HERG+ AKAP5 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)圖片。3 DNA 連接后的測序結(jié)果與 HERG 和 AKAP5 堿基序列比對，結(jié)果完全一致，證實(shí)了載體構(gòu)建成功，保證了 HERG 和 AKAP5 的正常表達(dá)。4 瓊脂糖凝膠 PCR 鑒定兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)染情況，結(jié)果顯示 AKAP5和 HERG 質(zhì)粒在 HEK293 細(xì)胞中能正常表達(dá)。

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4 記者 王丹;我國每年54萬人心臟性猝死[N];健康報(bào);2015年

5 本報(bào)記者 鄭穎t

本文編號：2723419