【摘要】：心臟性猝死(sudden cardiac death,SCD)是由于心臟無法有效泵血而導致的一種急性癥狀,其特征包括意識喪失和呼吸驟停,如果不及時治療,最終會引起死亡。嚴重的室性心律失常(ventricular arrhythmia,VA)是心臟性猝死最主要的原因之一。大量離子通道分布在心肌細胞膜,快激活延遲整流鉀電流(the rapid component of IK,IKr)在維持心肌動作電位的平臺期和3期復極期階段起重要作用,HERG(human ether-a-go-go-related gene)基因編碼IKr的α亞單位,HERG基因突變會引起心臟IKr電流減少,產(chǎn)生與7號常染色體有關的先天性長QT綜合征(long QT sydrome 2,LQTS-2)。LQTS通常與各種室性心律失常相關,特別是尖端扭轉(zhuǎn)性室速(torsades de piontes,TDP)。具有高發(fā)心臟性猝死的風險。研究表明激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)可通過抑制IKr電流實現(xiàn)對HERG通道的急性調(diào)節(jié)。然而,和急性調(diào)節(jié)不同,慢性調(diào)節(jié)發(fā)生于數(shù)小時或更晚時間,常涉及蛋白基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。相關文獻指出,在異源表達系統(tǒng)或心肌細胞中,長時間激活PKA可使HERG通道蛋白表達量明顯增加,其中PKA直接磷酸化HERG通道蛋白在這一過程中起到了一定的作用。A型激酶錨定蛋白(A-kinase anchoring protein,AKAP)是一組功能上相關而結構上不同的蛋白質(zhì),所有AKAP都能結合PKA。除此之外,AKAP還能與多種信號分子結合,構成信號復合物,靶向特定的區(qū)域,從而實現(xiàn)相應的功能。心肌細胞中共發(fā)現(xiàn)有十幾種AKAP,在心肌肥厚,心律失常,心肌缺血,心力衰竭等疾病中都觀察到AKAP的表達出現(xiàn)了明顯的改變,提示其在心臟的病理進程中起著重要的作用。AKAP5是一種廣泛表達的錨定蛋白,可以與PKA,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,Ca N),鈣調(diào)蛋白(calmodulin,Ca M)和其他信號分子相互作用,但AKAP5是否能通過結合PKA慢性調(diào)節(jié)HERG通道目前仍不清楚。因此,本研究擬在異源表達系統(tǒng)上,采用分子生物學,基因干預等技術研究AKAP5對HERG通道的慢性調(diào)節(jié)作用并初步探索其機制。本研究的完成給未來LQTS提供新的防治靶標,可以有效的預防心臟性猝死,具有重要的現(xiàn)實意義。第一部分:表達HERG通道蛋白和AKAP5錨定蛋白的細胞株的建立和鑒定目的:建立能單獨表達HERG鉀通道蛋白和AKAP5錨定蛋白與能同時表達上述兩個蛋白的HEK293細胞株。方法:用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將HERG基因和AKAP5基因分別轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞株上,HERG基因和AKAP5基因的轉(zhuǎn)染情況由瓊脂糖凝膠PCR鑒定,轉(zhuǎn)染后細胞HERG蛋白和AKAP5蛋白的表達情況由Western blot檢測。結果:瓊脂糖凝膠PCR結果顯示AKAP5和HERG質(zhì)粒在HEK293細胞中能正常表達,Western blot結果顯示AKAP5錨定蛋白和HERG鉀通道蛋白能正常表達。結論:成功建立了能單獨表達HERG和AKAP5與同時表達上述兩個蛋白的HEK293細胞株。第二部分:AKAP5對HERG鉀通道蛋白的慢性調(diào)節(jié)作用目的:在不同濃度或不同處理時間下對轉(zhuǎn)染后細胞應用PKA激動劑forskolin,觀察AKAP5錨定蛋白的存在是否能影響到HERG鉀通道蛋白的表達。方法:將轉(zhuǎn)染后細胞分為只表達HERG的HEK293-HERG組和同時表達HERG和AKAP5的HEK293-HERG+AKAP5組,在不同濃度或不同處理時間下應用PKA激動劑forskolin孵育該兩組細胞后,Western Blot檢測HERG蛋白的表達量。結果:對HEK293-HERG和HEK293-HERG+AKAP5兩組細胞應用PKA激動劑forskolin 1μm、10μm、1000μm 24小時或應用forskolin 10μm 6h、12h、24h后都可使HERG的表達量明顯上升。HEK293-HERG+AKAP5組相較于HEK293-HERG組,HERG的表達量的增加更為明顯。結論:AKAP5參與PKA對HERG鉀通道蛋白的慢性調(diào)控作用。第三部分:AKAP5對HERG鉀通道蛋白慢性調(diào)節(jié)作用的分子機制探討目的:在細胞水平闡明AKAP5對HERG鉀通道蛋白慢性調(diào)節(jié)的分子機制,即AKAP5可能通過特異性錨定和激活PKA慢性調(diào)節(jié)HERG鉀通道。方法:應用免疫熒光和免疫共沉淀檢測HERG,AKAP5和PKA的結合和共定位。結果:免疫熒光和免疫共沉淀顯示,HERG和PKA,AKAP5相互結合并共定位于細胞膜上。結論:AKAP5可能通過特異性錨定和激活PKA直接磷酸化HERG鉀通道蛋白慢性調(diào)節(jié)HERG鉀通道。
【學位授予單位】：皖南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541
【圖文】：

皖南醫(yī)學院碩士學位論文結 果1 HEK293 細胞的形態(tài)學特征在倒置顯微鏡下觀察，細胞貼壁生長，有少量細胞代謝物，總體上細胞形態(tài)完整，胞質(zhì)中央存在圓形細胞核，形態(tài)清楚，反光良好，細胞與細胞之間連接緊密，相互銜接。A B

圖 2：轉(zhuǎn)染后各組 HEK293 細胞培養(yǎng)圖片（100×）。C 和 D：轉(zhuǎn)染后 HEK293-HERG 轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)圖片。E 和 F：轉(zhuǎn)染后 HEK293-AKAP5 轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)圖片。G 和 H：轉(zhuǎn)染后HEK293-HERG+ AKAP5 共轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)圖片。3 DNA 連接后的測序結果與 HERG 和 AKAP5 堿基序列比對，結果完全一致，證實了載體構建成功，保證了 HERG 和 AKAP5 的正常表達。4 瓊脂糖凝膠 PCR 鑒定兩個基因的轉(zhuǎn)染情況，結果顯示 AKAP5和 HERG 質(zhì)粒在 HEK293 細胞中能正常表達。

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本文編號：2723419