【摘要】：目的:骨髓增殖性腫瘤(MPN)是一種以紅系、粒系或巨核系等一系或多系髓系細(xì)胞克隆性增殖為主的惡性血液學(xué)疾病。其中經(jīng)典的三類MPN疾病包括原發(fā)性血小板增多癥(ET)、真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)。這三種疾病的臨床表現(xiàn)比較相似,可以相互轉(zhuǎn)化,增加了臨床診斷的復(fù)雜性。原發(fā)性血小板增多癥(ET)是發(fā)病率最高的一種MPN疾病,其血液學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為骨髓中巨核細(xì)胞異常增生導(dǎo)致外周血中血小板一直升高。JAK2、MPL、CALR基因突變均可導(dǎo)致ET的發(fā)生。JAK2及MPL導(dǎo)致ET發(fā)生的分子機(jī)制較為清楚,但是CALR突變導(dǎo)致ET的分子機(jī)制還尚不清楚。近期研究認(rèn)為MPL-JAK2-STA T通路介導(dǎo)了ET的發(fā)生,然而此機(jī)制無法解釋CALR突變產(chǎn)生的巨核系過度增殖而粒系數(shù)量基本正常這一現(xiàn)象,為此我們認(rèn)為可能存在新的機(jī)制參與CALR突變致ET的過程。經(jīng)過前期工作我們發(fā)現(xiàn)PDGFRβ可能是介導(dǎo)CALR突變致ET發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵分子。本研究中我們將通過構(gòu)建CALR突變?nèi)司藓思?xì)胞株模型即UT-7/EPO,觀察PDGFRβ活性被抑制前后CALR突變促細(xì)胞增殖的影響,并初步探討PDGFRβ介導(dǎo)的CALR突變促巨核系惡性增殖的機(jī)制,即從細(xì)胞水平進(jìn)行PDGFRβ的功能驗(yàn)證。該研究將有助于提高CALR突變致ET發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí),并為精準(zhǔn)治療ET提供靶點(diǎn)。方法:1.研究PDGFRβ介導(dǎo)CALR突變促巨核系惡性增殖的作用選用UT-7/EPO細(xì)胞作為本研究的細(xì)胞模型,這種細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì):CALR type1突變組、CALR type2突變組、CALR野生組及空表達(dá)載體組,分別命名為CALR-MT1、CALR-MT2、CALR-WT、MSCV。其中CALR-MT1與CALR-MT2均為實(shí)驗(yàn)組,CALR-WT為陰性對(duì)照組,MSCV為空白對(duì)照組。構(gòu)建慢病毒重組表達(dá)載體p CDH1-MSCV-MCS1-T2A-cop GFP,包括CALR-MT1、CALR-MT2及CALR-WT。各表達(dá)質(zhì)粒即CALR-MT1、CALR-MT2、CALR-WT、MSCV分別與包裝質(zhì)粒p PACKH1(包括gag,rev,vsv)按一定比例通過脂質(zhì)體lipo2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(最好選用15代以內(nèi)的細(xì)胞株),轉(zhuǎn)染后48h,使用激光共聚焦顯微鏡來觀察GFP的表達(dá)情況,收取轉(zhuǎn)染后48h慢病毒懸液,0.45μM濾器過濾,分裝備用。獲得慢病毒顆粒后按最適比例分別感染UT-7/EPO細(xì)胞,72h激光共聚焦顯微鏡觀察GFP表達(dá)狀況。擴(kuò)大培養(yǎng)感染的細(xì)胞株,采用流式細(xì)胞儀(FACS)分選GFP陽性的克隆細(xì)胞,RT-PCR及Western bolt檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的表達(dá),建立及保存穩(wěn)定細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分兩組平行培養(yǎng)即PDGFRβ未抑制組和PDGFRβ抑制組。PDGFRβ抑制組選用PDGFRβ特異小分子化學(xué)抑制劑AG-1295進(jìn)行抑制。具體方法為:PDGFRβ抑制組中加入含AG-1295抑制劑的培養(yǎng)基(無EPO的10%FBS的RPMI 1640)對(duì)各組UT-7/EPO細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),收集各組不同時(shí)間點(diǎn)(0d、2d、4d、6d、8d)的細(xì)胞,用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;PDGFRβ未抑制組與PDGFRβ抑制組同時(shí)培養(yǎng),相同時(shí)間點(diǎn)(0d、2d、4d、6d、8d)收集細(xì)胞,用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。每組實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3遍,統(tǒng)計(jì)并比較每組同一時(shí)刻的抑制前后細(xì)胞增殖情況。2.初步探討PDGFRβ介導(dǎo)CALR突變促巨核系惡性增殖機(jī)制分別收集CALR突變的UT-7/EPO細(xì)胞及陰性對(duì)照細(xì)胞,提取蛋白上清,PBS洗滌兩次,裂解細(xì)胞并提取總蛋白,蛋白定量,Simple Western法分析磷酸化PI3K蛋白、磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平,PI3K蛋白、Akt蛋白非磷酸化表達(dá)水平。結(jié)果:1.PDGFRβ未抑制組(0μmol/L)中CALR-type1、CALR-type2呈現(xiàn)不依賴EPO增殖,而CALR-WT野生型組、MSCV空載體組細(xì)胞及UT-7/EPO空白細(xì)胞組在無EPO的情況下并沒有呈現(xiàn)增殖變化;但經(jīng)20μmol/L和30μmol/L AG-1295抑制PDGFRβ后各組細(xì)胞增殖呈現(xiàn)顯著受抑,且在第4d時(shí)PDGFRβ未抑制組和PDGFRβ抑制后的各組間細(xì)胞增殖程度有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.PDGFRβ未抑制組(0μmol/L)中CALR-type1、CALR-type2與CALR-WT野生型組相比AKT(Thr 308)磷酸化、p44/p42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr 204)磷酸化都沒有顯著差異,20μmol/LAG-1295的PDGFRβ抑制組中CALR-type1、CALR-type2與CALR-WT野生型組相比AKT磷酸化、ERK磷酸化也都沒有顯著差異;PDGFRβ未抑制組各組細(xì)胞與20μmol/LAG-1295的PDGFRβ抑制組的各組細(xì)胞相比AKT(Thr 308)磷酸化、p44/p42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr 204)磷酸化沒有顯著差異。結(jié)論:野生CALR的UT-7/EPO細(xì)胞在無EPO的條件下不能正常增殖,而突變CALR的UT-7/EPO細(xì)胞在無EPO的條件下可以增殖,提示PDGFRβ可能參與了CALR突變促進(jìn)細(xì)胞增殖的過程;同時(shí),PDGFRβ的抑制劑AG-1295可以抑制CALR突變的UT-7/EPO細(xì)胞的增殖能力,提示PDGFRβ參與了CALR突變促細(xì)胞增殖過程,為CALR突變體促細(xì)胞增殖的另外一個(gè)機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R558.3
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2 結(jié) 果2.1 各慢病毒表達(dá)載體的鑒定2.1.1 慢病毒 pCDH1-MSCV-MCS1-T2A-copGFP 質(zhì)粒的模式圖慢病毒載體系統(tǒng)即 pCDH1-MSCV-MCS1-T2A-copGFP，它將 MSCV 整合到慢病毒骨架，具有高的感染率。根據(jù)慢病毒質(zhì)粒圖譜，運(yùn)用 primer5.0 軟件對(duì) CALR 突變及野生型序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，各序列中均不存在 Not1、EcoR1，所以將 Not1 和EcoR1 作為 CALR 序列的克隆酶切位點(diǎn)（圖 1）。

21圖 2 CALR 各載體序列測(cè)序結(jié)果2.2 CALR 突變基因及其對(duì)照基因 UT-7/EPO 細(xì)胞模型的建立與鑒定2.2.1 建立 UT-7/EPO 細(xì)胞模型CALR 突變基因及對(duì)照基因即 CALR-type1、CALR-type2、CALR-WT、MSCV 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) UT-7/EPO 細(xì)胞株結(jié)果如下（圖 3-1）：將 CALR 各表達(dá)質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 15 代以內(nèi)的 293T 細(xì)胞株，48h 后，用激光共聚焦顯微鏡觀察，各組顯示均有GFP 綠色熒光的表達(dá)。分別收集慢病毒懸液，于 24 孔板里感染 UT-7/EPO 細(xì)胞株，24h 后換液，72h 后激光共聚焦顯微鏡觀察到 CALR-type1、CALR-type2、CALR-WT、

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6 孫e

本文編號(hào)：2722888