【摘要】：研究背景與目的:PRKAG2基因突變可導(dǎo)致心臟功能紊亂,典型特征是:心室預(yù)激、進(jìn)展性心臟傳導(dǎo)功能障礙、心臟肥厚,以及心肌細(xì)胞糖原過量沉積,被定義為PRKAG2心臟綜合征,屬于糖原累積性心肌病,少數(shù)病人可出現(xiàn)骨骼肌異常等心臟外病變。該病雖類似肥厚性心肌病,但與之不同的是,PRKAG2心臟綜合征無肌節(jié)排列紊亂,無或少量心肌纖維化。PRKAG2心臟綜合征雖然罕見,但經(jīng)家系分析顯示呈常染色體顯性遺傳,在受累家系中病患并不少見。目前,國內(nèi)外報(bào)道的PRKAG2基因突變至少有16種,含1種移碼突變和15種錯(cuò)義突變;絕大多數(shù)研究認(rèn)為正是這些突變導(dǎo)致腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性改變從而引發(fā)了各種臨床病癥。不同的突變位點(diǎn)導(dǎo)致的臨床表型輕重不一,而即使是同一突變,家系成員的臨床表現(xiàn)也各有差別。由于心臟取材受限,既往大部分的研究都采用轉(zhuǎn)基因或基因敲入小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象,但由于存在種屬差異,研究結(jié)果備受質(zhì)疑。尤其關(guān)于PRKAG2基因突變引起AMPK活性改變,一直存在升高和降低兩方面的爭議。隨著人誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)的日益成熟,人們可以將病人的體細(xì)胞重編程為干細(xì)胞,再分化為心肌細(xì)胞,用于疾病的機(jī)制研究;這不僅規(guī)避了種屬差異的局限,也克服了臨床取材的難題,并能為實(shí)驗(yàn)研究提供足量的標(biāo)本。2007年,張靜等報(bào)道了一個(gè)家族性傳導(dǎo)異常伴心室預(yù)激及心肌肥厚的家系;通過基因測序,發(fā)現(xiàn)PRKAG2基因外顯子3上(cDNA298位點(diǎn))的堿基尿嘌呤G被腺嘌呤A代替,導(dǎo)致編碼的氨基酸(100位點(diǎn))甘氨酸Gly被絲氨酸Ser代替,引起了PRKAG2心臟綜合征。雖然研究者相繼在CCL13細(xì)胞、斑馬魚及小鼠模型對該病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了更深入的研究,但均不能真實(shí)體現(xiàn)病患心肌細(xì)胞的狀態(tài)。結(jié)合當(dāng)前興起的誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù),我們試圖從病患層面對該病進(jìn)行研究。目前關(guān)于PRKAG2心臟綜合征的誘導(dǎo)干細(xì)胞模型的研究較少,該病具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚;描述該病心肌細(xì)胞糖原含量、AMPK活性、AMPKγ2表達(dá)量、細(xì)胞大小及心肌細(xì)胞功能等特征指標(biāo)的研究尚不全面。本研究的目的為:建立PRKAG2心臟綜合征病患源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞,并進(jìn)行相關(guān)的特征檢測。研究方法:(1)PRKAG2心臟綜合征家系臨床資料收集及基因檢測:共入選9人,其中家系成員6人,成員配偶3人。并采集病史、血液及尿液標(biāo)本,行體格檢查及輔助檢查(包括心肌酶、心電圖、心臟彩超、動(dòng)態(tài)心電圖等);提取DNA,利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增PRKAG2基因外顯子3行基因測序,依此結(jié)果并結(jié)合臨床表現(xiàn)分組,各組選1名組員的外周靜脈血做全外顯子組測序;(2)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的培養(yǎng)及心肌細(xì)胞定向分化:分離外周靜脈血獲得外周血單核細(xì)胞或分離尿液獲得尿液脫落細(xì)胞,并擴(kuò)增細(xì)胞;選用Epi5附加體iPSC重組試劑盒,采用基因非整合無飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù),將體細(xì)胞誘導(dǎo)、培養(yǎng)為多能干細(xì)胞(iPSCs),并對其進(jìn)行驗(yàn)證。隨后,采用小分子化合物分化法將iPSCs定向分化為心肌細(xì)胞(CMs),并對CMs進(jìn)行鑒定;(3)病患源iPSC-CMs的特征檢測:對培養(yǎng)時(shí)間為30-90天的iPSC-CMs,通過過碘酸-雪夫(PAS)染色試劑盒定性分析細(xì)胞中的糖原含量。利用細(xì)胞免疫熒光染色,計(jì)算心肌細(xì)胞特異性表達(dá)抗體TNT或α-actinin呈陽性的iPSC-CMs表面積,統(tǒng)計(jì)分析各組細(xì)胞大小。采用Western blotting檢測各組樣品中AMPKα、p-AMPKα、AMPKγ2的含量,AMPK活性由p-AMPKα與AMPKα比值獲得。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位和離子通道電流。研究結(jié)果:(1)經(jīng)全外顯子檢測,在Ⅲ-3的PRKAG2基因中發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn),導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生改變,分別為R302Q和G100S。綜合病史、輔助檢查及外顯子3基因測序,可分為三組:病患組、家系健康組和非家系健康組。病患組包括4名家系成員Ⅱ-1、Ⅲ-2、Ⅲ-3和Ⅳ-2。該組基因檢測證實(shí)存在PRKAG2基因突變。除Ⅳ-2外,均有不適癥狀,如胸悶、心慌等;心臟彩超發(fā)現(xiàn)心肌肥厚,或心電圖提示房顫、心動(dòng)過緩、束支傳導(dǎo)阻滯等心律失常。Ⅳ-2屬于該組中較特殊者,心電圖提示竇性心動(dòng)過緩,基因檢測有突變基因,但患者目前無不適癥狀,心臟彩超未見異常。家系健康組包括2名家系成員Ⅲ-1、Ⅳ-3,無明顯不適癥狀,輔助檢查未見明顯異常,且基因檢測也無基因突變。非家系健康組包含3名成員配偶,未見明顯異常發(fā)現(xiàn);(2)有5名入選者的體細(xì)胞成功誘導(dǎo)為iPSCs,為病患組Ⅲ-2、Ⅲ-3,家系健康組Ⅳ-3,非家系健康組Ⅲ-2妻、Ⅲ-3妻,iPSCs多能性鑒定結(jié)果為:堿性磷酸酶染色呈陽性,細(xì)胞免疫熒光染色顯示細(xì)胞表面多能性標(biāo)記Oct-4、Sox-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog均呈陽性,實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示多能性相關(guān)基因Nanog、REX1、ESG1、DPPA2、UTF1表達(dá)均增高。iPSCs均能定向分化為CMs,并通過顯微鏡下觀察到的細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng),以及細(xì)胞免疫熒光染色心肌特異性蛋白TNI、TNT、α-actinin呈陽性,得以證實(shí);(3)病患源iPSC-CMs特征檢測:PAS染色顯示,三組iPSC-CMs糖原未見明顯差異,表明病患組iPSC-CMs無明顯糖原沉積。細(xì)胞免疫熒光染色表明,病患組iPSC-CMs面積(514.1±288.2μm~2)大于家系健康組(325.0±289.2μm~2,P0.05)和非家系健康組iPSC-CMs(283.6±233.4μm~2,P0.05);證實(shí)病患組iPSC-CMs細(xì)胞增大。Western blotting結(jié)果顯示,病患組和非家系健康組iPSC-CMs的AMPK活性未見明顯差異(0.94624±0.06390和0.85370±0.03645,P=0.08),但均高于家系健康組(0.73588±0.12625,P0.05);表明病患組iPSC-CMs的AMPK活性無明顯改變。病患組AMPKγ2含量高于2健康組,表明突變的基因?qū)е铝四繕?biāo)蛋白表達(dá)增加。細(xì)胞膜片鉗檢測記錄到類似心室肌、心房肌動(dòng)作電位,并觀察到病患組iPSC-CMs存在高鈉、高鈣通道電流(1500-2000pA),而家系健康組iPSC-CMs未觀察到該現(xiàn)象。研究結(jié)論:本課題成功地將PRKAG2心臟綜合征(突變位點(diǎn)為R302Q合并G100S)病患體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞并最終定向分化為心肌細(xì)胞;證實(shí)了病患源iPSC-CMs具有PRKAG2心臟綜合征部分特征,如細(xì)胞增大、AMPKγ2表達(dá)增多、鈉鈣通道電流異常;但未見明顯糖原沉積,AMPK活性無明顯改變。本課題iPSC-CMs檢測量仍偏少;完善分化和培養(yǎng)條件以獲得足量的相對成熟的iPSC-CMs是后期研究需要解決的難題�？傊�,本課題誘導(dǎo)分化的iPSC-CMs可以作為后續(xù)研究PRKAG2心臟綜合征發(fā)病機(jī)制的一種有效模型。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R54
【圖文】：

圖 1-1 2016-2017 年入選者關(guān)系圖譜-1：家系成員，女，43 歲，與先證者同輩，為Ⅱ-1 之女。無胸悶、胸厥、心慌、氣短、肌痛、肌無力，僅訴頸椎、腰椎痛。無高血壓、糖尿（圖 1-3）及動(dòng)態(tài)心電圖提示竇性心律，未見異常。體檢結(jié)論：超重，比增高；心臟結(jié)構(gòu)功能及彩色血流未見異常。-1 之夫：作為對照納入實(shí)驗(yàn)；男，52 歲，無胸悶、胸痛、頭暈、暈厥、肌痛、肌無力。無高血壓、糖尿病史。BNP 10pg/ml（參考值 <100pg/m

- 24 -圖 1-2 兄弟二人心電圖不同表現(xiàn)Ⅲ-3 心電圖表現(xiàn)為短 PR 間期，完全性左束支傳導(dǎo)阻滯，左心室肥大伴勞損；Ⅲ-2 則表現(xiàn)為心動(dòng)過緩，左心室高電壓。

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本文編號(hào)：2719853