【摘要】：目的:肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)的過(guò)度增殖是低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)所致肺血管重塑的基礎(chǔ)病理變化,特別是遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)改變對(duì)HPH的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。而低氧、多種生長(zhǎng)因子等因素通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了細(xì)胞異常增殖過(guò)程的啟動(dòng)和調(diào)控。探明其病理發(fā)生機(jī)制,找到可能逆轉(zhuǎn)HPH所致血管重塑的治療靶點(diǎn)意義重大。近年來(lái),基于蛋白激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控受到廣泛關(guān)注。在對(duì)蛋白激酶的相關(guān)研究中,發(fā)現(xiàn)經(jīng)典型蛋白激酶C(cPKC)與低氧誘導(dǎo)的PASMCs異常增殖和HPH可能相關(guān)。此外,隨著小鼠基因動(dòng)物模型應(yīng)用于肺動(dòng)脈高壓疾病研究,建立穩(wěn)定的小鼠遠(yuǎn)端PASMCs原代培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞分子水平實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。那么,關(guān)于cPKC各亞型是否參與和調(diào)控低氧誘導(dǎo)下的PASMCs異常增殖?目前尚不清楚。鑒于以上背景,本實(shí)驗(yàn)主要研究:1.借鑒國(guó)外的PASMCs磁性分離培養(yǎng)方法,并加以改良,探討建立穩(wěn)定的小鼠遠(yuǎn)端PASMCs原代培養(yǎng)技術(shù)。2.利用原代培養(yǎng)的小鼠遠(yuǎn)端PASMCs建立低氧模型,探討低氧對(duì)PASMCs增殖及cPKC各亞型表達(dá)的影響。3.通過(guò)藥物干預(yù)或病毒轉(zhuǎn)染體外原代培養(yǎng)的小鼠遠(yuǎn)端PASMCs,探討cPKC特定亞型對(duì)低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及ERK1/2、Akt表達(dá)的影響。方法:1.利用Dynal MPC-1磁分離器分離含鐵粉的遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈血管,進(jìn)行細(xì)胞的原代培養(yǎng);顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并通過(guò)平滑肌細(xì)胞smoothelin多克隆抗體和myosin heavy chain多克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光雙染色法鑒定。2.用cPKC各亞型特異性抗體,采用免疫印跡、免疫熒光技術(shù)鑒定cPKC各亞型在正常小鼠PASMCs上的表達(dá)情況。3.對(duì)正常小鼠PASMCs進(jìn)行低氧(O_2濃度3%)培養(yǎng),建立細(xì)胞缺氧模型。4.采用CCK法和Brdu法檢測(cè)常氧和低氧條件下細(xì)胞增殖能力變化。5.采用免疫熒光技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、間接免疫熒光流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)常氧和低氧條件下不同時(shí)相點(diǎn)cPKC亞型蛋白表達(dá)變化。6.應(yīng)用PKC激動(dòng)劑(PMA)、PKCα抑制劑(safingol)、PKCβI抑制劑(Go6976)、PKCβII抑制劑(LY333531)分別干預(yù)細(xì)胞后,在常氧和低氧條件下,采用免疫印跡法觀察cPKC亞型蛋白表達(dá)變化,以及ERK1/2、Akt磷酸化水平變化。7.應(yīng)用PKCα、PKCβ的慢病毒載體,通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)特異性敲減目標(biāo)基因活性,采用免疫印跡法觀察低氧誘導(dǎo)小鼠PASMCs中cPKC亞型蛋白表達(dá)變化,以及ERK1/2、Akt磷酸化水平變化。結(jié)果:1.經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物smoothelin和myosin heavy chain免疫熒光鑒定,證實(shí)從小鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈原代培養(yǎng)的細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞。2.經(jīng)改良后,采用磁分離原理對(duì)小鼠遠(yuǎn)端PASMCs進(jìn)行分離和原代培養(yǎng)技術(shù)具有操作難度低、重復(fù)性好的特點(diǎn),并能獲得穩(wěn)定的高純度小鼠PASMCs系。3.通過(guò)免疫印跡技術(shù)、免疫熒光技術(shù),均檢測(cè)到cPKCα(75 kDa)、cPKCβI(77 kDa)和cPKCβII(77 kDa)在小鼠PASMCs中表達(dá),而cPKCγ(78 kDa)沒(méi)有檢測(cè)到。4.采用CCK法和Brdu法,檢測(cè)到經(jīng)低氧和常氧培養(yǎng)24h、48h、72h后,小鼠PASMCs中的CCK吸光度值和Brdu陽(yáng)性細(xì)胞率均較常氧組顯著增高,其中低氧72h時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞的增殖能力提高最明顯。5.采用免疫熒光技術(shù)定性分析,發(fā)現(xiàn)經(jīng)低氧培養(yǎng)24h、48h、72h后,cPKCα的蛋白表達(dá)較常氧組均明顯增高;cPKCβI、βII的蛋白表達(dá)在低氧培養(yǎng)48h、72h后均高于常氧組。6.采用免疫印跡技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)的定量分析,均檢測(cè)到cPKCα、βI、βII的蛋白表達(dá)在低氧培養(yǎng)24h、48h、72h各時(shí)相點(diǎn)明顯高于常氧組。7.采用Brdu法,檢測(cè)到用safingol、Go6976、LY333531分別抑制cPKCα、βI和βII時(shí),低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖能力受到明顯抑制,我們還觀察到PMA在常氧條件下可顯著促進(jìn)PASMCs的增殖能力;此外經(jīng)過(guò)PKCα、PKCβ的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,也發(fā)現(xiàn)低氧轉(zhuǎn)染組的PASMCs增殖能力較空載對(duì)照組明顯下降。8.通過(guò)免疫印跡技術(shù)還觀察到,用safingol、Go6976、LY333531分別抑制cPKCα、βI和βII表達(dá)后,低氧誘導(dǎo)的PASMCs中ERK1/2、Akt的磷酸化水平較對(duì)照組顯著降低,PMA可使常氧條件下PASMCs中ERK1/2、Akt的磷酸化水平增高;我們還利用病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)cPKCα、β的表達(dá)進(jìn)行特異性敲減,發(fā)現(xiàn)低氧條件下,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后均可使細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平顯著降低,而Akt磷酸化水平較對(duì)照組無(wú)明顯變化。結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良后的磁性分離方法成功的進(jìn)行了小鼠遠(yuǎn)端PASMCs的原代培養(yǎng),獲得的細(xì)胞純度及存活率高,可用于下一步實(shí)驗(yàn)。解決了遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈取材困難的難點(diǎn),該方法可操作性強(qiáng),重復(fù)性好。2.本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了低氧可誘導(dǎo)小鼠遠(yuǎn)端PASMCs的過(guò)度增殖。3.驗(yàn)證了在小鼠PASMCs上存在cPKCα、cPKCβI和cPKCβII的表達(dá),而沒(méi)有cPKCγ的表達(dá)。4.低氧可上調(diào)小鼠遠(yuǎn)端PASMCs中cPKCα、cPKCβI和cPKCβII的蛋白表達(dá),低氧誘導(dǎo)小鼠遠(yuǎn)端PASMCs的異常增殖可能是通過(guò)上調(diào)cPKCα、βI和βII信號(hào)通路來(lái)調(diào)控的。5.藥物干預(yù)或者病毒轉(zhuǎn)染可使PASMCs中cPKCα、βI和βII表達(dá)下降,可顯著抑制低氧誘導(dǎo)的小鼠遠(yuǎn)端PASMCs異常增殖,其作用機(jī)制可能與cPKCα、βI和βII蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。6.低氧可能通過(guò)上調(diào)cPKCα、βI和βII的蛋白表達(dá),使得ERK1/2磷酸化水平增高,最終引起小鼠遠(yuǎn)端PASMCs的異常增殖,參與HPH的形成過(guò)程。7.調(diào)控cPKCα、βI和βII的表達(dá)可能有利于改善肺血管重塑的形成,基于cPKC亞型的靶向治療可望成為今后HPH治療的新方向。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R544.1
【圖文】：

8①在小鼠腹部偏左側(cè)做切口；②暴露腎臟，剪斷腎動(dòng)脈除血；③沿胸骨左側(cè)剪開(kāi)胸骨，充分暴露胸腔；④PBS 液經(jīng)右心室注入灌洗右心室、肺動(dòng)脈除血；⑤肺部外觀呈白色；⑥暴露氣管，下穿手術(shù)縫合線(xiàn)，將留置針插入氣管，結(jié)扎固定；⑦PAAgarose 液經(jīng)右心室注入右心室、肺動(dòng)脈；⑧肺部外觀呈灰色；⑨經(jīng)氣管留置針，Lung Agarose 液注入肺部。圖 1 遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈血管的制備1.2.2 PASMCs 的原代培養(yǎng)第 1 天：(1) 超凈工作臺(tái)上，將取下的心肺組織置于 60mm 培養(yǎng)皿中分離除去心臟、胸腺、氣管等鄰近組織，然后用無(wú)菌的 PBS 液漂洗肺組織，直至凝血洗凈；(2) 更換培養(yǎng)皿后，加入 1ml 無(wú)菌預(yù)冷后的 PBS 液，用手術(shù)刀將肺組織碎化為1~2mm 組織塊。然后用移液管反復(fù)抽吸吹打組織塊，移入 50ml 的無(wú)菌離心管中，并用 PBS 液沖洗收集培養(yǎng)皿中剩余肺組織；

密度低處呈單層生長(zhǎng)，密度高處呈重疊生長(zhǎng)，表現(xiàn)出典型的血管平滑肌細(xì)胞“峰—谷”狀生長(zhǎng)特點(diǎn)（圖2D）。A：第 1 天；B：第 7 天；C：第 10 天；D：第 13~15 天圖 2 原代培養(yǎng)的小鼠 PASMCs，不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)（倒置顯微鏡下, 40×）2.2 PASMCs 的純化及存活率小鼠遠(yuǎn)端 PASMCs 原代培養(yǎng)時(shí)，最初從含鐵的肺小動(dòng)脈組織周?chē)莱龅募?xì)胞為

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本文編號(hào)：2719040