【摘要】：目的:肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)的過度增殖是低氧性肺動脈高壓(HPH)所致肺血管重塑的基礎(chǔ)病理變化,特別是遠端肺小動脈的結(jié)構(gòu)改變對HPH的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。而低氧、多種生長因子等因素通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路參與了細胞異常增殖過程的啟動和調(diào)控。探明其病理發(fā)生機制,找到可能逆轉(zhuǎn)HPH所致血管重塑的治療靶點意義重大。近年來,基于蛋白激酶轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控受到廣泛關(guān)注。在對蛋白激酶的相關(guān)研究中,發(fā)現(xiàn)經(jīng)典型蛋白激酶C(cPKC)與低氧誘導的PASMCs異常增殖和HPH可能相關(guān)。此外,隨著小鼠基因動物模型應用于肺動脈高壓疾病研究,建立穩(wěn)定的小鼠遠端PASMCs原代培養(yǎng)技術(shù)是細胞分子水平實驗研究的基礎(chǔ)。那么,關(guān)于cPKC各亞型是否參與和調(diào)控低氧誘導下的PASMCs異常增殖?目前尚不清楚。鑒于以上背景,本實驗主要研究:1.借鑒國外的PASMCs磁性分離培養(yǎng)方法,并加以改良,探討建立穩(wěn)定的小鼠遠端PASMCs原代培養(yǎng)技術(shù)。2.利用原代培養(yǎng)的小鼠遠端PASMCs建立低氧模型,探討低氧對PASMCs增殖及cPKC各亞型表達的影響。3.通過藥物干預或病毒轉(zhuǎn)染體外原代培養(yǎng)的小鼠遠端PASMCs,探討cPKC特定亞型對低氧誘導的細胞增殖及ERK1/2、Akt表達的影響。方法:1.利用Dynal MPC-1磁分離器分離含鐵粉的遠端肺小動脈血管,進行細胞的原代培養(yǎng);顯微鏡下觀察細胞形態(tài),并通過平滑肌細胞smoothelin多克隆抗體和myosin heavy chain多克隆抗體對培養(yǎng)的細胞進行免疫熒光雙染色法鑒定。2.用cPKC各亞型特異性抗體,采用免疫印跡、免疫熒光技術(shù)鑒定cPKC各亞型在正常小鼠PASMCs上的表達情況。3.對正常小鼠PASMCs進行低氧(O_2濃度3%)培養(yǎng),建立細胞缺氧模型。4.采用CCK法和Brdu法檢測常氧和低氧條件下細胞增殖能力變化。5.采用免疫熒光技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、間接免疫熒光流式細胞技術(shù)檢測常氧和低氧條件下不同時相點cPKC亞型蛋白表達變化。6.應用PKC激動劑(PMA)、PKCα抑制劑(safingol)、PKCβI抑制劑(Go6976)、PKCβII抑制劑(LY333531)分別干預細胞后,在常氧和低氧條件下,采用免疫印跡法觀察cPKC亞型蛋白表達變化,以及ERK1/2、Akt磷酸化水平變化。7.應用PKCα、PKCβ的慢病毒載體,通過病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)特異性敲減目標基因活性,采用免疫印跡法觀察低氧誘導小鼠PASMCs中cPKC亞型蛋白表達變化,以及ERK1/2、Akt磷酸化水平變化。結(jié)果:1.經(jīng)細胞形態(tài)學、平滑肌細胞標記物smoothelin和myosin heavy chain免疫熒光鑒定,證實從小鼠遠端肺動脈原代培養(yǎng)的細胞是平滑肌細胞。2.經(jīng)改良后,采用磁分離原理對小鼠遠端PASMCs進行分離和原代培養(yǎng)技術(shù)具有操作難度低、重復性好的特點,并能獲得穩(wěn)定的高純度小鼠PASMCs系。3.通過免疫印跡技術(shù)、免疫熒光技術(shù),均檢測到cPKCα(75 kDa)、cPKCβI(77 kDa)和cPKCβII(77 kDa)在小鼠PASMCs中表達,而cPKCγ(78 kDa)沒有檢測到。4.采用CCK法和Brdu法,檢測到經(jīng)低氧和常氧培養(yǎng)24h、48h、72h后,小鼠PASMCs中的CCK吸光度值和Brdu陽性細胞率均較常氧組顯著增高,其中低氧72h時相點細胞的增殖能力提高最明顯。5.采用免疫熒光技術(shù)定性分析,發(fā)現(xiàn)經(jīng)低氧培養(yǎng)24h、48h、72h后,cPKCα的蛋白表達較常氧組均明顯增高;cPKCβI、βII的蛋白表達在低氧培養(yǎng)48h、72h后均高于常氧組。6.采用免疫印跡技術(shù)、流式細胞技術(shù)的定量分析,均檢測到cPKCα、βI、βII的蛋白表達在低氧培養(yǎng)24h、48h、72h各時相點明顯高于常氧組。7.采用Brdu法,檢測到用safingol、Go6976、LY333531分別抑制cPKCα、βI和βII時,低氧誘導的PASMCs增殖能力受到明顯抑制,我們還觀察到PMA在常氧條件下可顯著促進PASMCs的增殖能力;此外經(jīng)過PKCα、PKCβ的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細胞后,也發(fā)現(xiàn)低氧轉(zhuǎn)染組的PASMCs增殖能力較空載對照組明顯下降。8.通過免疫印跡技術(shù)還觀察到,用safingol、Go6976、LY333531分別抑制cPKCα、βI和βII表達后,低氧誘導的PASMCs中ERK1/2、Akt的磷酸化水平較對照組顯著降低,PMA可使常氧條件下PASMCs中ERK1/2、Akt的磷酸化水平增高;我們還利用病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)對cPKCα、β的表達進行特異性敲減,發(fā)現(xiàn)低氧條件下,轉(zhuǎn)染細胞后均可使細胞中ERK1/2磷酸化水平顯著降低,而Akt磷酸化水平較對照組無明顯變化。結(jié)論:1.本實驗通過改良后的磁性分離方法成功的進行了小鼠遠端PASMCs的原代培養(yǎng),獲得的細胞純度及存活率高,可用于下一步實驗。解決了遠端肺小動脈取材困難的難點,該方法可操作性強,重復性好。2.本實驗驗證了低氧可誘導小鼠遠端PASMCs的過度增殖。3.驗證了在小鼠PASMCs上存在cPKCα、cPKCβI和cPKCβII的表達,而沒有cPKCγ的表達。4.低氧可上調(diào)小鼠遠端PASMCs中cPKCα、cPKCβI和cPKCβII的蛋白表達,低氧誘導小鼠遠端PASMCs的異常增殖可能是通過上調(diào)cPKCα、βI和βII信號通路來調(diào)控的。5.藥物干預或者病毒轉(zhuǎn)染可使PASMCs中cPKCα、βI和βII表達下降,可顯著抑制低氧誘導的小鼠遠端PASMCs異常增殖,其作用機制可能與cPKCα、βI和βII蛋白表達上調(diào)有關(guān)。6.低氧可能通過上調(diào)cPKCα、βI和βII的蛋白表達,使得ERK1/2磷酸化水平增高,最終引起小鼠遠端PASMCs的異常增殖,參與HPH的形成過程。7.調(diào)控cPKCα、βI和βII的表達可能有利于改善肺血管重塑的形成,基于cPKC亞型的靶向治療可望成為今后HPH治療的新方向。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R544.1
【圖文】：

8①在小鼠腹部偏左側(cè)做切口；②暴露腎臟，剪斷腎動脈除血；③沿胸骨左側(cè)剪開胸骨，充分暴露胸腔；④PBS 液經(jīng)右心室注入灌洗右心室、肺動脈除血；⑤肺部外觀呈白色；⑥暴露氣管，下穿手術(shù)縫合線，將留置針插入氣管，結(jié)扎固定；⑦PAAgarose 液經(jīng)右心室注入右心室、肺動脈；⑧肺部外觀呈灰色；⑨經(jīng)氣管留置針，Lung Agarose 液注入肺部。圖 1 遠端肺動脈血管的制備1.2.2 PASMCs 的原代培養(yǎng)第 1 天：(1) 超凈工作臺上，將取下的心肺組織置于 60mm 培養(yǎng)皿中分離除去心臟、胸腺、氣管等鄰近組織，然后用無菌的 PBS 液漂洗肺組織，直至凝血洗凈；(2) 更換培養(yǎng)皿后，加入 1ml 無菌預冷后的 PBS 液，用手術(shù)刀將肺組織碎化為1~2mm 組織塊。然后用移液管反復抽吸吹打組織塊，移入 50ml 的無菌離心管中，并用 PBS 液沖洗收集培養(yǎng)皿中剩余肺組織；

密度低處呈單層生長，密度高處呈重疊生長，表現(xiàn)出典型的血管平滑肌細胞“峰—谷”狀生長特點（圖2D）。A：第 1 天；B：第 7 天；C：第 10 天；D：第 13~15 天圖 2 原代培養(yǎng)的小鼠 PASMCs，不同培養(yǎng)時間的細胞形態(tài)（倒置顯微鏡下, 40×）2.2 PASMCs 的純化及存活率小鼠遠端 PASMCs 原代培養(yǎng)時，最初從含鐵的肺小動脈組織周圍爬出的細胞為

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本文編號：2719040