【摘要】：研究背景腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一種發(fā)病率高且危害大的慢性炎癥血管疾病。盡管外科手術(shù)日益進(jìn)步,其一旦破裂,死亡率仍超過80%。目前研究認(rèn)為延緩AAA的發(fā)展是遏制這一災(zāi)難性后果發(fā)生的關(guān)鍵。在臨床上,戒煙、血壓、血脂和血糖控制等生活方式和代謝改善是延緩AAA發(fā)展的常規(guī)措施,但仍不足以控制AAA進(jìn)展。現(xiàn)在研究觀點(diǎn)阻斷AAA形成的發(fā)病機(jī)制可能被視為阻止或延緩AAA發(fā)展的一種有前景的潛在策略。N6甲基腺苷(M6A)介導(dǎo)超過80%的RNA甲基化,被認(rèn)為是真核生物中最常見的信使RNA轉(zhuǎn)錄后修飾,也是非編碼RNA常見的轉(zhuǎn)錄后修飾。RNA中的M6A修飾通過促進(jìn)前體RNA剪切、信使RNA翻譯和增強(qiáng)RNA穩(wěn)定性等途徑在各種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。目前的研究表明RNAM6A轉(zhuǎn)錄后修飾在多種病理生理過程中起著關(guān)鍵作用,如癌細(xì)胞生長、急性髓細(xì)胞白血病、胚胎干細(xì)胞生長分化和T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。近期研究也發(fā)現(xiàn)RNA M6A轉(zhuǎn)錄后修飾在如心肌缺血和心肌細(xì)胞再生中起著關(guān)鍵作用。有趣的是,我們的初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在AAA樣本中,RNA的M6A修飾水平增高,并且這種上調(diào)是由M6A轉(zhuǎn)移酶METTL3升高引起的。這些現(xiàn)象結(jié)果發(fā)現(xiàn)引起思考:METTL3或RNA中的M6A修飾是否參與AAA的進(jìn)展。近期的其他研究也暗示這一可能,研究發(fā)現(xiàn)METTL3增加了炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),激活了與AAA發(fā)生發(fā)展相關(guān)的NF-κ B信號通路。此外,METTL3可促進(jìn)了 miRNA前體的發(fā)生M6A修飾,從而增加M6A修飾介導(dǎo)的miRNA前體加工,進(jìn)而增加成熟的微小RNA(miRNA)形成。考慮到既往大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在主動脈瘤的形成中是至關(guān)重要的。綜上所述,我們假設(shè)METTL3通過促進(jìn)M6A RNA的修飾,從而促進(jìn)miRNA前體加工成成熟miRNA,導(dǎo)致血管炎癥的發(fā)生進(jìn)而參與AAA的形成。為了驗(yàn)證假設(shè),我們在兩個(gè)AAA模型中探討了 METTL3對AAA發(fā)展的影響。進(jìn)一步對METTL3的作用機(jī)制進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)METTL3促進(jìn)與血管衰老,炎癥相關(guān)的miR-34a的前體加工成成熟miR-34a。再者,為了說明miR-34a在AAA發(fā)生中起關(guān)鍵作用,我們還通過腺相關(guān)病毒進(jìn)行敲低和過表達(dá)miR-34a,并探索其潛在機(jī)制。研究方法與結(jié)果一,METTL3功能實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)在ApoE-/-小鼠中,用AAV病毒敲低METTL3抑制AngⅡ誘導(dǎo)的腹主動脈瘤發(fā)生率,減少血管最大直徑,抑制血管巨噬細(xì)胞浸潤和抑制彈力纖維降解,而且抑制金屬蛋白酶2(MMP2),P21以及單核趨化蛋白1(MCP1)的表達(dá);(2)在C57BL/6J小鼠中過表達(dá)METTL3則促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的腹主動脈瘤形成,相應(yīng)的病理變化結(jié)果趨勢也與敲低實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反;(3)METTL3促進(jìn)主動脈瘤發(fā)生的現(xiàn)象也在氯化鈣模型上得到驗(yàn)證。二,機(jī)制研究研究發(fā)現(xiàn),(1)MeRIP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腹主動脈中pri-miR-34a M6A甲基化位點(diǎn)的M6A修飾水平增加,敲低和過表達(dá)METTL3分別抑制和增加pri-miR-34a的M6A甲基化位點(diǎn)的M6A修飾水平;(2)敲低METTL3顯著抑制miR-34a的表達(dá),增加pri-miR-34a的表達(dá);(3)抑制METTL3表達(dá)可以減少甲基化的RNA與RNA剪接相關(guān)蛋白DGCR8的結(jié)合。結(jié)論本研究證實(shí),METTL3可通過增加pri-miR-34a的M6A修飾,促進(jìn)M6A修飾介導(dǎo)的pri-miR-34a的前體加工成熟miR-34a,進(jìn)而抑制SIRT1的表達(dá),促進(jìn)血管平滑肌衰老和血管炎癥,從而發(fā)揮促進(jìn)腹主動脈瘤發(fā)生和發(fā)展作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R543.1
【圖文】：

ＲＮＡ甲摧化去轉(zhuǎn)移酶，這兩大類酶則司維持的。顧名}、義ＭｆｔＡ邋ＲＮＡ甲基化轉(zhuǎn)移逡逑酶是維持Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ甲柚化水＇丨／：，而Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ甲裉化ｉ轉(zhuǎn)移酶坫擦除Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ逡逑甲基化水平。實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ結(jié)果（圖１－２）表明：在腹主動脈瘤模型中，Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ逡逑甲基化去轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量基本在兩種標(biāo)本中表達(dá)沒有變化，提示腹主動脈瘤Ｍ６Ａ逡逑ＲＮＡ甲基化水平增高不是Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ甲基化去轉(zhuǎn)移酶引起的。逡逑Ｉ—Ｉ邋Ｓａｌｉｎｅ邋■邋ＡＡ逡逑ｔｉｌｌ逡逑Ｕ邋Ｕ邋ＭＥＴＴＬ４邋ＡＬＫＢＨ５邋ＹＴＨＤＦ２邋ＦＴＯ邋ＫＩＡＡ１４２９逡逑１７逡逑

逡逑圖１－２邋Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ甲基化去轉(zhuǎn)移酶在鹽水組和血管緊張素ＩＩ組的ｍＲＮＡ水平。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ邋－２邋Ｔｈｅ邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋Ｍ６Ａ邋ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ邋ｉｎ邋Ａｎｇ邋ＩＩ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＡＡＡ邋ｍｏｄｅｌ．逡逑既然ＲＮＡ甲基化去轉(zhuǎn)移酶沒有表達(dá)差異，接著我們進(jìn)一步探索ＲＮＡ甲基化逡逑轉(zhuǎn)移酶在兩組中的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ（圖１－３顯示ＭＥＴＴＬ３邋（６．９±０．６０倍，＊Ｐ＜０．０５，逡逑ｎ＝４）和ＭＥＴＴＬ１４邋（２．０５±０．２７６倍，＊Ｐ＜０．０５，邋ｎ＝４）的ｍＲＮＡ表達(dá)水平顯著高于對照逡逑組的水平（Ｐ＜０．０１），尤其是ＭＥＴＴＬ３顯著高表達(dá)，提示腹主動脈瘤中的Ｍ６Ａ逡逑修飾的差異可能是由ＭＥＴＴＬ３升高導(dǎo)致的。逡逑［□Ｓａｌｉｎｅ邐ＡＡ逡逑８邋＊＊逡逑．１邐ｉ逡逑＜＆邐ｅ邋－邐丨逡逑Ｉ逡逑ｃｒ邐４－邐化逡逑＾邐■邐Ｉ逡逑Ｉ邐ＪｎＭ邐ｎｉ邋ｎａ逡逑ＭＥＴＴＬ３邐ＭＥＴＴＬ１４邐ＷＴＡＰ逡逑圖１－３邋Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ甲基化轉(zhuǎn)移酶在鹽水組和血管緊張素ＩＩ組的ｍＲＮＡ水平。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－３邋Ｔｈｅ邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋Ｍ６Ａ邋ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ｉｎ邋Ａｎｇ邋ＩＩ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＡＡＡ邋ｍｏｄｅｌ．逡逑此外，我們進(jìn)一步在兩組標(biāo)本中檢測了邋ＭＥＴＴＬ３的蛋白水平改變。Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｏｌｔｉｎｇ的結(jié)果顯示：ＭＥＴＴＬ３的蛋白水平也是在腹主動脈瘤中高表達(dá)（圖１－４），逡逑正如既往研究所報(bào)道

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