【摘要】：目的:血管鈣化(vascular calcification)是血管重塑性疾病普遍存在的共同的病理表現(xiàn),其主要特征為血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)發(fā)生成骨細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)化;除此之外還包括基質(zhì)囊泡的形成、細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的增加、以及各種成軟骨分化相關(guān)蛋白的出現(xiàn)或表達(dá)上調(diào)等。VSMC表型轉(zhuǎn)化是血管鈣化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此,表型轉(zhuǎn)化抑制因子可能成為防止血管鈣化的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。小檗堿(Berberine,BBR)通過激活A(yù)MPK/p53/p21/Cip1通路,抑制Ras/Rac1/Cyclin D/Cdks通路,進(jìn)而抑制血小板源生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)誘導(dǎo)的VSMC的增殖。在本研究中,我們觀察了BBR對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC鈣化的影響,并對其分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討,為臨床防治心血管鈣化提供更可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1 VSMC培養(yǎng)選取60-80 g SD雄性大鼠(清潔級),于無菌環(huán)境下使用貼塊法分離胸腹主動脈培養(yǎng)大鼠VSMC。待細(xì)胞生長匯合至75%-85%后,使用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2細(xì)胞活力檢測將處于對數(shù)生長期的VSMC接種于96孔板中,置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后換用無血清培養(yǎng)基。利用CCK8試劑盒,分別測定BBR刺激不同濃度或者不同時間后,對細(xì)胞活力的影響。3細(xì)胞內(nèi)鈣含量測定將細(xì)胞重懸于含2%Triton-X100的PBS中,渦旋震蕩使細(xì)胞充分裂解。離心后收集上清,進(jìn)行蛋白定量,按照鈣含量測定試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑后,用酶標(biāo)儀測定610 nm處的吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞中的鈣含量。4 ALP活性檢測將細(xì)胞重懸于含2%Triton-X100的PBS中,渦旋震蕩使細(xì)胞充分裂解。離心后收集上清,進(jìn)行蛋白定量,按照ALP檢測試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑后,用酶標(biāo)儀測定在405 nm處的吸光度值。5 Western blot分析將收集好的細(xì)胞重懸于細(xì)胞裂解液中,離心后收集上清進(jìn)行蛋白定量。取等量的蛋白進(jìn)行Western Blot,檢測AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)及p-AMPK的表達(dá)。結(jié)果:1.BBR對VSMC活力的影響細(xì)胞活力隨著BBR刺激濃度的增高逐漸降低,呈濃度依賴性,100μM以上濃度的BBR明顯降低細(xì)胞活力;細(xì)胞活力隨著BBR刺激時間的延長逐漸降低,呈時間依賴性,刺激48 h后可以明顯降低細(xì)胞活力。因此我們選擇50μM BBR刺激細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.BBR對VSMC鈣含量的影響PDGF-BB刺激48 h后可以明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣含量增加,然而,給予BBR預(yù)處理后,PDGF-BB誘導(dǎo)鈣含量增加的現(xiàn)象被抑制。結(jié)果表明,BBR可以抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC鈣化。3.BBR對ALP活性的影響PDGF-BB刺激48 h時可以明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ALP活性,然而,給予BBR預(yù)處理后,PDGF-BB誘導(dǎo)ALP活性增加的現(xiàn)象被抑制。結(jié)果表明,BBR通過抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ALP活性,進(jìn)而抑制細(xì)胞鈣化。4.BBR對AMPK表達(dá)的影響與對照組相比,隨著PDGF-BB刺激時間的延長,AMPK的表達(dá)逐漸增加,24 h達(dá)到高峰,48 h仍維持在較高水平,說明PDGF-BB可以誘導(dǎo)VSMC中AMPK的表達(dá)。然而,用50μM BBR預(yù)處理24 h后,無論有無PDGF-BB刺激,BBR都對AMPK的表達(dá)沒有影響。5.BBR對AMPK磷酸化的影響與對照組相比,隨著PDGF-BB刺激時間的延長,AMPK磷酸化水平?jīng)]有明顯變化。然而,50μM BBR預(yù)處理24 h后,無論有無PDGF-BB刺激,BBR可以明顯促進(jìn)AMPK磷酸化。結(jié)果表明,BBR可能通過誘導(dǎo)AMPK磷酸化,抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC鈣化。結(jié)論:1.BBR抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC鈣化。2.BBR可能通過誘導(dǎo)AMPK的磷酸化活化,抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC鈣化。
【圖文】：

圖 1 BBR 對 VSMC 細(xì)胞活力的影響Fig.1Effects of BBR on VSMC viabilityere stimulated with BBR at 0, 25, 50, 100, 200, 400, 800or 24 h. Cell viability was measured by CCK8 kit. *P < 0.05. B: VSMCs were stimulated with 50 μM BBR for 6, 12, 2ell viability was measured by CCK8 kit. *P < 0.05, compare

BBR對ALP活性的影響
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R54

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本文編號：2710617