【摘要】：目的:血管鈣化(vascular calcification)是血管重塑性疾病普遍存在的共同的病理表現,其主要特征為血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)發(fā)生成骨細胞樣表型轉化;除此之外還包括基質囊泡的形成、細胞內堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的增加、以及各種成軟骨分化相關蛋白的出現或表達上調等。VSMC表型轉化是血管鈣化發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié),因此,表型轉化抑制因子可能成為防止血管鈣化的潛在干預靶點。小檗堿(Berberine,BBR)通過激活AMPK/p53/p21/Cip1通路,抑制Ras/Rac1/Cyclin D/Cdks通路,進而抑制血小板源生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)誘導的VSMC的增殖。在本研究中,我們觀察了BBR對PDGF-BB誘導的VSMC鈣化的影響,并對其分子機制進行了初步探討,為臨床防治心血管鈣化提供更可靠的理論和實驗依據。方法:1 VSMC培養(yǎng)選取60-80 g SD雄性大鼠(清潔級),于無菌環(huán)境下使用貼塊法分離胸腹主動脈培養(yǎng)大鼠VSMC。待細胞生長匯合至75%-85%后,使用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取3-5代細胞進行實驗。2細胞活力檢測將處于對數生長期的VSMC接種于96孔板中,置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h后換用無血清培養(yǎng)基。利用CCK8試劑盒,分別測定BBR刺激不同濃度或者不同時間后,對細胞活力的影響。3細胞內鈣含量測定將細胞重懸于含2%Triton-X100的PBS中,渦旋震蕩使細胞充分裂解。離心后收集上清,進行蛋白定量,按照鈣含量測定試劑盒說明書加入相應試劑后,用酶標儀測定610 nm處的吸光度值,并計算細胞中的鈣含量。4 ALP活性檢測將細胞重懸于含2%Triton-X100的PBS中,渦旋震蕩使細胞充分裂解。離心后收集上清,進行蛋白定量,按照ALP檢測試劑盒說明書加入相應試劑后,用酶標儀測定在405 nm處的吸光度值。5 Western blot分析將收集好的細胞重懸于細胞裂解液中,離心后收集上清進行蛋白定量。取等量的蛋白進行Western Blot,檢測AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)及p-AMPK的表達。結果:1.BBR對VSMC活力的影響細胞活力隨著BBR刺激濃度的增高逐漸降低,呈濃度依賴性,100μM以上濃度的BBR明顯降低細胞活力;細胞活力隨著BBR刺激時間的延長逐漸降低,呈時間依賴性,刺激48 h后可以明顯降低細胞活力。因此我們選擇50μM BBR刺激細胞24 h進行后續(xù)實驗。2.BBR對VSMC鈣含量的影響PDGF-BB刺激48 h后可以明顯促進細胞內鈣含量增加,然而,給予BBR預處理后,PDGF-BB誘導鈣含量增加的現象被抑制。結果表明,BBR可以抑制PDGF-BB誘導的VSMC鈣化。3.BBR對ALP活性的影響PDGF-BB刺激48 h時可以明顯促進細胞內ALP活性,然而,給予BBR預處理后,PDGF-BB誘導ALP活性增加的現象被抑制。結果表明,BBR通過抑制PDGF-BB誘導的ALP活性,進而抑制細胞鈣化。4.BBR對AMPK表達的影響與對照組相比,隨著PDGF-BB刺激時間的延長,AMPK的表達逐漸增加,24 h達到高峰,48 h仍維持在較高水平,說明PDGF-BB可以誘導VSMC中AMPK的表達。然而,用50μM BBR預處理24 h后,無論有無PDGF-BB刺激,BBR都對AMPK的表達沒有影響。5.BBR對AMPK磷酸化的影響與對照組相比,隨著PDGF-BB刺激時間的延長,AMPK磷酸化水平沒有明顯變化。然而,50μM BBR預處理24 h后,無論有無PDGF-BB刺激,BBR可以明顯促進AMPK磷酸化。結果表明,BBR可能通過誘導AMPK磷酸化,抑制PDGF-BB誘導的VSMC鈣化。結論:1.BBR抑制PDGF-BB誘導的VSMC鈣化。2.BBR可能通過誘導AMPK的磷酸化活化,抑制PDGF-BB誘導的VSMC鈣化。
【圖文】：

圖 1 BBR 對 VSMC 細胞活力的影響Fig.1Effects of BBR on VSMC viabilityere stimulated with BBR at 0, 25, 50, 100, 200, 400, 800or 24 h. Cell viability was measured by CCK8 kit. *P < 0.05. B: VSMCs were stimulated with 50 μM BBR for 6, 12, 2ell viability was measured by CCK8 kit. *P < 0.05, compare

BBR對ALP活性的影響
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R54

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本文編號：2710617