發(fā)布時間：2020-06-11 10:28

【摘要】：研究背景:缺血性心臟病是當今威脅人類健康的“頭號殺手”,雖然經(jīng)皮冠狀動脈介入等治療措施能夠迅速疏通堵塞的血管,但是會引起嚴重的心肌二次損傷,即心肌缺血/再灌注(MI/R)損傷。因此,研究有效的內(nèi)源性心肌保護策略意義重大。流行病學調查和實驗研究均表明,有氧運動不僅能降低心血管疾病的危險因素,而且具有直接的心臟保護作用,但其作用機制尚不清楚。近年發(fā)現(xiàn),運動可致機體多種組織分泌運動因子(exerkine,如白細胞介素-6、鳶尾素等),后者以旁分泌或內(nèi)分泌方式介導運動的全身效應。目前,尋找新的運動因子并挖掘其潛在的應用價值已成為國際運動與健康科學研究的一個重要方向。外泌體(exosome)是細胞分泌的納米級(30-100 nm)囊泡,能夠通過其攜帶的mi RNAs,多肽和蛋白質等生物活性物質向臨近或遠距組織器官傳遞信息,影響細胞功能。因此,外泌體介導了一種新的細胞間通訊方式。循環(huán)中外泌體的濃度高達1010數(shù)量級,并且其與機體狀態(tài)密切相關。新近研究發(fā)現(xiàn),健康受試者單次急性運動后即刻,循環(huán)外泌體的數(shù)量增加,并且循環(huán)外泌體中超過300種蛋白質的量也明顯增加,提示循環(huán)外泌體可能在運動的系統(tǒng)性適應中發(fā)揮重要作用。但是,目前長期有氧運動對循環(huán)外泌體的影響及其在運動促進心臟健康中的作用尚不清楚。實驗目的:1.明確長期有氧運動條件下循環(huán)外泌體的變化。2.揭示循環(huán)外泌體在運動心臟保護中的作用及其主要機制。實驗方法:1.招募空軍軍醫(yī)大學賽艇隊運動員和不運動對照學員研究長期有氧運動對人循環(huán)外泌體數(shù)量及成分的影響。2.構建SD大鼠4周游泳運動模型研究長期有氧運動對大鼠循環(huán)外泌體數(shù)量、成分及功能的影響。3.在末次運動結束后24 h時采用超速離心法分離血漿外泌體,用透射電鏡和蛋白免疫印跡技術鑒定外泌體,采用納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術分析提取的外泌體粒徑分布情況。4.構建SD大鼠MI/R(30 min/24 h)模型和原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞缺氧/復氧(H/R,12 h/3 h)模型,評估長期有氧運動誘導的循環(huán)外泌體的心肌保護作用。5.采用mi RNA高通量測序技術分析運動組和安靜對照組大鼠循環(huán)外泌體中mi RNAs的表達差異。采用實時定量PCR(q RT-PCR)技術檢測外泌體和組織中特定mi RNA的水平。6.采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)和蛋白免疫印跡技術確定特定mi RNA靶基因。7.采用修飾的腺相關病毒(AAV9)和mi RNA agomir在體下調或者上調心臟特定mi RNA水平。8.采用Graph Pad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗結果:1.與安靜對照組大鼠相比,運動組大鼠MI/R后,心肌梗死面積減小,血清乳酸脫氫酶(LDH)活性明顯降低,表明4周游泳運動能夠保護心肌,減輕MI/R損傷。2.賽艇運動員和不運動對照學員相比,循環(huán)外泌體的數(shù)量在末次運動結束24 h后無統(tǒng)計學差異;運動組大鼠和安靜對照組大鼠相比,循環(huán)外泌體的數(shù)量在末次運動結束24 h后也無明顯變化。但是,運動組大鼠血漿外泌體(Exe-exo)具有明顯的心肌保護作用,其預孵育心肌細胞48 h能夠減輕心肌細胞H/R損傷,表現(xiàn)為心肌細胞凋亡和LDH釋放減少,心肌細胞活力提高。安靜對照組大鼠循環(huán)外泌體(Sed-exo)預孵育心肌細胞48 h未見顯著減輕心肌細胞H/R損傷。3.接受Exe-exo心肌點注射大鼠,MI/R后心肌梗死面積較PBS注射組明顯減小(35.6±4.3%vs.58.6±3.5%,p0.01;n=11),血清LDH水平也明顯降低,并且心臟功能(左室內(nèi)壓最大上升/下降速率和左室舒張末壓)明顯改善。與PBS注射組相比,Sed-exo無明顯的心肌保護作用。4.采用Illumina Hi Seq 2500高通量測序平臺對Exe-exo和Sed-exo包含的mi RNAs進行分析,發(fā)現(xiàn)14個差異表達的mi RNAs(篩選條件為量相差2倍以上并且p0.05)。進一步采用q RT-PCR對這14個差異表達的mi RNAs進行驗證,最終確定了12個差異表達的mi RNAs。5.采用體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞H/R模型對上述差異表達的mi RNAs進行功能篩選,發(fā)現(xiàn)mi R-342-5p具有顯著的心肌保護作用,能夠減輕H/R引起的心肌細胞凋亡和LDH釋放,同時增加細胞活力。6.與不運動對照學員相比,賽艇運動員血漿外泌體mi R-342-5p的水平增加了80%。7.生物信息學分析,蛋白免疫印跡和雙熒光素酶報告基因分析結果表明,促凋亡基因Caspase9和Jnk2是mi R-342-5p的靶基因,并且用mi R-342-5p mimic預孵育心肌細胞能夠抑制H/R引起的Caspase3,Caspase9激活并降低磷酸化Jnk2(Thr183/Tyr185)水平,提示mi R-342-5p能夠通過靶向抑制促凋亡基因Caspase9和Jnk2發(fā)揮心肌保護作用。8.mi R-342-5p mimic和inhibitor可分別增加和降低體外培養(yǎng)的心肌細胞磷酸化Akt(Ser473)水平,但對Erk1/2的磷酸化(Thr202/Tyr204)無明顯影響。生物信息學分析,蛋白免疫印跡和雙熒光素酶報告基因分析結果表明,磷酸酶Ppm1f是mi R-342-5p的靶基因。用小干擾RNA下調心肌細胞Ppm1f蛋白水平可增加Akt(Ser473)磷酸化水平,并且抑制H/R導致的心肌細胞凋亡。9.長期有氧運動增加心臟,骨骼肌,主動脈,肝臟,脂肪組織,腎臟以及脾臟mi R-342-5p的前體和成熟體水平,其中主動脈增加最多。循環(huán)外泌體中不含mi R-342-5p的前體,提示長期有氧運動增加的循環(huán)外泌體mi R-342-5p來源于多個組織。10.長期有氧運動增加心臟mi R-342-5p水平,降低Caspase9,Jnk2和Ppm1f的蛋白表達量并增加Akt(Ser473)磷酸化水平。4周游泳訓練開始前1周給予大鼠心肌點注射攜帶抗mi R-342-5p序列的AAV9,能夠顯著降低運動大鼠心臟mi R-342-5p水平,并且減弱長期有氧運動的心臟保護作用,表現(xiàn)為MI/R條件下心肌梗死面積增大和心肌細胞凋亡增加。預先心肌點注射mi R-342-5p agomir增加心臟mi R-342-5p水平可減小大鼠MI/R心肌梗死面積。結論:1.長期有氧運動結束24 h后,循環(huán)外泌體的數(shù)量雖無明顯改變,但是其發(fā)生了“質變”,具有心臟保護作用,能夠減輕心肌缺血/再灌注損傷。2.mi R-342-5p是長期有氧運動誘導的循環(huán)外泌體中發(fā)揮心臟保護作用的關鍵成分,其通過靶向抑制促凋亡分子(Caspase9和Jnk2)和激活生存信號(Akt)發(fā)揮心肌保護作用。本研究揭示了長期有氧運動通過循環(huán)外泌體發(fā)揮心臟保護作用的一個新機制,提示外泌體mi R-342-5p是一種新的心臟保護性運動因子,為運動裨益心臟健康和開發(fā)心臟保護性藥物提供了新的實驗依據(jù)。
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學博士學位論文mPTP 異常開放取得了很好的治療效果(30,31)。在 MI/R 過程中，mPTP 被認為是很有潛力的治療靶點。1.5 炎癥反應雖然 MI/R 過程中伴隨明顯的炎癥細胞浸潤，炎癥因子的異常升高，，但是，目前仍不清楚炎癥是 MI/R 損傷的伴隨現(xiàn)象還是始作俑者(32)。一些動物實驗結果表明抗炎治療，包括抗體和藥物，可以減輕 MI/R 損傷(33)，但是在臨床上抗炎治療并沒有取得明顯的效果(34)。

空軍軍醫(yī)大學博士學位論文亞硝基化修飾，抑制心肌細胞凋亡等不良事件的發(fā)生，并且，NO 可以對線粒體傳遞鏈中復合酶Ⅰ進行修飾，抑制自由基的生成，減輕心肌細胞損傷(51)。研究無論是在心肌缺血前，缺血時還是在再灌注過程中，外源性補充亞硝酸鹽能夠實驗動物 MI/R 損傷(54,55)。此外，相對于正常小鼠，eNOS 有缺陷小鼠運動的保護作用明顯減弱(56)，提示 eNOS/NO 系統(tǒng)在運動的心臟保護作用中發(fā)揮重要
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R54

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本文編號：2707767