【摘要】：研究背景:缺血性心臟病是當(dāng)今威脅人類健康的“頭號殺手”,雖然經(jīng)皮冠狀動脈介入等治療措施能夠迅速疏通堵塞的血管,但是會引起嚴(yán)重的心肌二次損傷,即心肌缺血/再灌注(MI/R)損傷。因此,研究有效的內(nèi)源性心肌保護(hù)策略意義重大。流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究均表明,有氧運(yùn)動不僅能降低心血管疾病的危險(xiǎn)因素,而且具有直接的心臟保護(hù)作用,但其作用機(jī)制尚不清楚。近年發(fā)現(xiàn),運(yùn)動可致機(jī)體多種組織分泌運(yùn)動因子(exerkine,如白細(xì)胞介素-6、鳶尾素等),后者以旁分泌或內(nèi)分泌方式介導(dǎo)運(yùn)動的全身效應(yīng)。目前,尋找新的運(yùn)動因子并挖掘其潛在的應(yīng)用價值已成為國際運(yùn)動與健康科學(xué)研究的一個重要方向。外泌體(exosome)是細(xì)胞分泌的納米級(30-100 nm)囊泡,能夠通過其攜帶的mi RNAs,多肽和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)向臨近或遠(yuǎn)距組織器官傳遞信息,影響細(xì)胞功能。因此,外泌體介導(dǎo)了一種新的細(xì)胞間通訊方式。循環(huán)中外泌體的濃度高達(dá)1010數(shù)量級,并且其與機(jī)體狀態(tài)密切相關(guān)。新近研究發(fā)現(xiàn),健康受試者單次急性運(yùn)動后即刻,循環(huán)外泌體的數(shù)量增加,并且循環(huán)外泌體中超過300種蛋白質(zhì)的量也明顯增加,提示循環(huán)外泌體可能在運(yùn)動的系統(tǒng)性適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。但是,目前長期有氧運(yùn)動對循環(huán)外泌體的影響及其在運(yùn)動促進(jìn)心臟健康中的作用尚不清楚。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.明確長期有氧運(yùn)動條件下循環(huán)外泌體的變化。2.揭示循環(huán)外泌體在運(yùn)動心臟保護(hù)中的作用及其主要機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.招募空軍軍醫(yī)大學(xué)賽艇隊(duì)運(yùn)動員和不運(yùn)動對照學(xué)員研究長期有氧運(yùn)動對人循環(huán)外泌體數(shù)量及成分的影響。2.構(gòu)建SD大鼠4周游泳運(yùn)動模型研究長期有氧運(yùn)動對大鼠循環(huán)外泌體數(shù)量、成分及功能的影響。3.在末次運(yùn)動結(jié)束后24 h時采用超速離心法分離血漿外泌體,用透射電鏡和蛋白免疫印跡技術(shù)鑒定外泌體,采用納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術(shù)分析提取的外泌體粒徑分布情況。4.構(gòu)建SD大鼠MI/R(30 min/24 h)模型和原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R,12 h/3 h)模型,評估長期有氧運(yùn)動誘導(dǎo)的循環(huán)外泌體的心肌保護(hù)作用。5.采用mi RNA高通量測序技術(shù)分析運(yùn)動組和安靜對照組大鼠循環(huán)外泌體中mi RNAs的表達(dá)差異。采用實(shí)時定量PCR(q RT-PCR)技術(shù)檢測外泌體和組織中特定mi RNA的水平。6.采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)和蛋白免疫印跡技術(shù)確定特定mi RNA靶基因。7.采用修飾的腺相關(guān)病毒(AAV9)和mi RNA agomir在體下調(diào)或者上調(diào)心臟特定mi RNA水平。8.采用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.與安靜對照組大鼠相比,運(yùn)動組大鼠MI/R后,心肌梗死面積減小,血清乳酸脫氫酶(LDH)活性明顯降低,表明4周游泳運(yùn)動能夠保護(hù)心肌,減輕MI/R損傷。2.賽艇運(yùn)動員和不運(yùn)動對照學(xué)員相比,循環(huán)外泌體的數(shù)量在末次運(yùn)動結(jié)束24 h后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;運(yùn)動組大鼠和安靜對照組大鼠相比,循環(huán)外泌體的數(shù)量在末次運(yùn)動結(jié)束24 h后也無明顯變化。但是,運(yùn)動組大鼠血漿外泌體(Exe-exo)具有明顯的心肌保護(hù)作用,其預(yù)孵育心肌細(xì)胞48 h能夠減輕心肌細(xì)胞H/R損傷,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞凋亡和LDH釋放減少,心肌細(xì)胞活力提高。安靜對照組大鼠循環(huán)外泌體(Sed-exo)預(yù)孵育心肌細(xì)胞48 h未見顯著減輕心肌細(xì)胞H/R損傷。3.接受Exe-exo心肌點(diǎn)注射大鼠,MI/R后心肌梗死面積較PBS注射組明顯減小(35.6±4.3%vs.58.6±3.5%,p0.01;n=11),血清LDH水平也明顯降低,并且心臟功能(左室內(nèi)壓最大上升/下降速率和左室舒張末壓)明顯改善。與PBS注射組相比,Sed-exo無明顯的心肌保護(hù)作用。4.采用Illumina Hi Seq 2500高通量測序平臺對Exe-exo和Sed-exo包含的mi RNAs進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)14個差異表達(dá)的mi RNAs(篩選條件為量相差2倍以上并且p0.05)。進(jìn)一步采用q RT-PCR對這14個差異表達(dá)的mi RNAs進(jìn)行驗(yàn)證,最終確定了12個差異表達(dá)的mi RNAs。5.采用體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞H/R模型對上述差異表達(dá)的mi RNAs進(jìn)行功能篩選,發(fā)現(xiàn)mi R-342-5p具有顯著的心肌保護(hù)作用,能夠減輕H/R引起的心肌細(xì)胞凋亡和LDH釋放,同時增加細(xì)胞活力。6.與不運(yùn)動對照學(xué)員相比,賽艇運(yùn)動員血漿外泌體mi R-342-5p的水平增加了80%。7.生物信息學(xué)分析,蛋白免疫印跡和雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果表明,促凋亡基因Caspase9和Jnk2是mi R-342-5p的靶基因,并且用mi R-342-5p mimic預(yù)孵育心肌細(xì)胞能夠抑制H/R引起的Caspase3,Caspase9激活并降低磷酸化Jnk2(Thr183/Tyr185)水平,提示mi R-342-5p能夠通過靶向抑制促凋亡基因Caspase9和Jnk2發(fā)揮心肌保護(hù)作用。8.mi R-342-5p mimic和inhibitor可分別增加和降低體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞磷酸化Akt(Ser473)水平,但對Erk1/2的磷酸化(Thr202/Tyr204)無明顯影響。生物信息學(xué)分析,蛋白免疫印跡和雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果表明,磷酸酶Ppm1f是mi R-342-5p的靶基因。用小干擾RNA下調(diào)心肌細(xì)胞Ppm1f蛋白水平可增加Akt(Ser473)磷酸化水平,并且抑制H/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。9.長期有氧運(yùn)動增加心臟,骨骼肌,主動脈,肝臟,脂肪組織,腎臟以及脾臟mi R-342-5p的前體和成熟體水平,其中主動脈增加最多。循環(huán)外泌體中不含mi R-342-5p的前體,提示長期有氧運(yùn)動增加的循環(huán)外泌體mi R-342-5p來源于多個組織。10.長期有氧運(yùn)動增加心臟mi R-342-5p水平,降低Caspase9,Jnk2和Ppm1f的蛋白表達(dá)量并增加Akt(Ser473)磷酸化水平。4周游泳訓(xùn)練開始前1周給予大鼠心肌點(diǎn)注射攜帶抗mi R-342-5p序列的AAV9,能夠顯著降低運(yùn)動大鼠心臟mi R-342-5p水平,并且減弱長期有氧運(yùn)動的心臟保護(hù)作用,表現(xiàn)為MI/R條件下心肌梗死面積增大和心肌細(xì)胞凋亡增加。預(yù)先心肌點(diǎn)注射mi R-342-5p agomir增加心臟mi R-342-5p水平可減小大鼠MI/R心肌梗死面積。結(jié)論:1.長期有氧運(yùn)動結(jié)束24 h后,循環(huán)外泌體的數(shù)量雖無明顯改變,但是其發(fā)生了“質(zhì)變”,具有心臟保護(hù)作用,能夠減輕心肌缺血/再灌注損傷。2.mi R-342-5p是長期有氧運(yùn)動誘導(dǎo)的循環(huán)外泌體中發(fā)揮心臟保護(hù)作用的關(guān)鍵成分,其通過靶向抑制促凋亡分子(Caspase9和Jnk2)和激活生存信號(Akt)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究揭示了長期有氧運(yùn)動通過循環(huán)外泌體發(fā)揮心臟保護(hù)作用的一個新機(jī)制,提示外泌體mi R-342-5p是一種新的心臟保護(hù)性運(yùn)動因子,為運(yùn)動裨益心臟健康和開發(fā)心臟保護(hù)性藥物提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文mPTP 異常開放取得了很好的治療效果(30,31)。在 MI/R 過程中，mPTP 被認(rèn)為是很有潛力的治療靶點(diǎn)。1.5 炎癥反應(yīng)雖然 MI/R 過程中伴隨明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，炎癥因子的異常升高，，但是，目前仍不清楚炎癥是 MI/R 損傷的伴隨現(xiàn)象還是始作俑者(32)。一些動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗炎治療，包括抗體和藥物，可以減輕 MI/R 損傷(33)，但是在臨床上抗炎治療并沒有取得明顯的效果(34)。

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文亞硝基化修飾，抑制心肌細(xì)胞凋亡等不良事件的發(fā)生，并且，NO 可以對線粒體傳遞鏈中復(fù)合酶Ⅰ進(jìn)行修飾，抑制自由基的生成，減輕心肌細(xì)胞損傷(51)。研究無論是在心肌缺血前，缺血時還是在再灌注過程中，外源性補(bǔ)充亞硝酸鹽能夠?qū)嶒?yàn)動物 MI/R 損傷(54,55)。此外，相對于正常小鼠，eNOS 有缺陷小鼠運(yùn)動的保護(hù)作用明顯減弱(56)，提示 eNOS/NO 系統(tǒng)在運(yùn)動的心臟保護(hù)作用中發(fā)揮重要
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R54

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本文編號：2707767