【摘要】：研究背景動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ),是一種慢性炎癥性疾病,其特征是脂質(zhì)和炎性細(xì)胞在中、大動脈壁積聚。血管內(nèi)皮氧化損傷被認(rèn)為是動脈粥樣硬化的首發(fā)和關(guān)鍵步驟。在生理狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細(xì)胞有著重要的生理功能,如血管內(nèi)外的物質(zhì)交換,合成和釋放血管活性介質(zhì)等。近年來國內(nèi)外越來越多的研究表明氧化應(yīng)激、LOX-1與自噬在動脈粥樣硬化形成和發(fā)展中有著交互錯雜的關(guān)系。在氧化應(yīng)激環(huán)境Lox-1參與ox-LDL的結(jié)合、吞噬及蛋白分解等一系列生物過程,從而達(dá)到清除受體的生物功能。自噬是細(xì)胞在外界環(huán)境各種刺激因素的影響下,細(xì)胞對受損的細(xì)胞器異常的蛋白質(zhì)及病原體進(jìn)行降解的生物學(xué)過程。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的長度大約為18-25個核苷酸的非編碼RNA,能夠調(diào)節(jié)mRNA的降解或抑制翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。在體內(nèi)miRNA在許多生物學(xué)功能中起著重要的作用如細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞凋亡等過程。研究發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激下內(nèi)皮細(xì)胞中許多miRNA的表達(dá)譜發(fā)生變化,其中,MiRNA199a-5P的變化最為顯著。然而目前在慢性氧化應(yīng)激環(huán)境下miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞的自噬和糖酵解水平的影響機(jī)制目前尚不明確。因此,我們在慢性氧化應(yīng)激環(huán)境下miRNA199a-5p對內(nèi)皮細(xì)糖酵解和自噬的影響。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象,研究miRNA199a-5p在慢性氧化應(yīng)激環(huán)境下對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解和自噬調(diào)控機(jī)制。研究目的研究miRNA199a-5p在慢性氧化應(yīng)激環(huán)境下對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解和自噬中的調(diào)控作用。研究方法體外建立慢性氧化應(yīng)激內(nèi)皮細(xì)胞模型,并在此基礎(chǔ)上向內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miRNA199a-5p激動劑及抑制劑后,利用PCR,Western Blot等技術(shù)檢測miRNA199a-5p對內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解和自噬的影響。研究結(jié)果在正常環(huán)境下,與對照組Lox-1含量比較,激動劑組降低、抑制劑組升高。與對照組HK2含量比較,激動劑組HK2含量升高;抑制劑組HK2蛋白含量降低。正常環(huán)境下,與正常組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ含量比較,激動劑組升高,抑制劑組降低。我們還發(fā)現(xiàn)Beclin-1含量、P62含量、ATG4含量在激動劑組降低而抑制劑組升高。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給予細(xì)胞ox-LDL 72小時刺激后,與對照組Lox-1含量(0.053±0.000)比較,激動劑組Lox-1含量(0.015±0.002)降低、激動劑1組細(xì)胞Lox-1含量(0.006±0.002)降低;抑制劑組Lox-1含量蛋白含量(0.088±0.005)升高、抑制劑組Lox-1蛋白含量(0.093±0.002)升高。與對照組HK2含量(0.233±0.003)比較,激動劑組HK2含量(0.213±0.003)降低、激動劑1組細(xì)胞HK2含量(0.123±0.008)降低;抑制劑組HK2含量(0.311±0.006)增多,抑制劑1組細(xì)胞HK2含量(1.573±0.012)增多。與對照組LC3Ⅱ/Ⅰ含量(11.253±0.235)比較,激動劑組LC3Ⅱ/Ⅰ含量(28.653±0.509)升高、激動劑2組細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ含量(13.803±0.454)升高;抑制劑組LC3Ⅱ/Ⅰ含量(5.853±0.117)降低,抑制劑2組細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ含量(4.443±0.181)降低。與對照組Beclin-1含量(0.821±0.028)比較,激動劑組Beclin-1含量(0.738±0.012)降低,激動劑1組細(xì)胞Beclin-1含量(0.385±0.292)與降低;抑制劑組Beclin-1含量(1.373±0.038)增加、抑制劑1組細(xì)胞Beclin-1含量(1.405±0.041)增加。與對照組P62含量(2.196±0.031)比較,激動劑組P62含量(1.634±0.038)降低、激動劑1組細(xì)胞P62含量(1.543±0.066)降低;抑制劑組P62(2.630±0.057)增多,抑制劑1組P62含量(2.250±0.026)沒有差異。與對照組ATG4含量(0.327±0.005)比較,激動劑組ATG4含量(0.227±0.005)降低、激動劑2組細(xì)胞ATG4含量(0.243±0.003)降低;抑制劑組ATG4含量(0.306±0.006)沒有差異、抑制劑2組細(xì)胞ATG4含量(0.139±0.003)減少。我們同時還測定了己糖激酶活性,發(fā)現(xiàn)與對照組己糖激酶活性測定值19.730±1..806μ/gprot比較,激動劑組己糖激酶活性測定值7.167±3.941μ/gprot降低,激動劑2組己糖激酶活性測定值34.937±3.506μ/gprot升高;抑制劑組己糖激酶活性32.670±1.453μ/gprot升高,抑制劑2組己糖激酶活性11.450±1.006μ/gprot顯著降低(圖9B)。同時我們又測定了細(xì)胞內(nèi)丙酮酸含量,發(fā)現(xiàn)與對照組丙酮酸含量測定值0.048±0.001μmol/mgprot比較,激動劑組測定值0.043±0.002μmol/mgprot無差異,激動劑1組測定值0.147±0.001μmol/mgprot沒有升高;抑制劑組測定值0.056±0.001μmol/mgprot升高,抑制劑1組測定值0.042±0.001μmol/mgprot降低。我們進(jìn)一步測定miRNA199a-5p含量,發(fā)現(xiàn)以對照組為參照,空白組miRNA199a-5p含量(1.026±0.029)與對照組沒有差異,激動劑組miRNA199a-5p含量(1.769±0.069)、激動劑1組含量(1.403±0.026)高于對照組;抑制劑組miRNA199a-5p含量(0.560±0.035)、抑制劑1組含量(0.467±0.044)低于對照組。與對照組cav-1含量(6.780±0.169)比較,激動劑組cav-1含量(7.230±0.115)、激動劑1組細(xì)胞cav-1含量(6.53±0.154)沒有差異;抑制劑組cav-1含量(13.230±0.138)升高,抑制劑2組細(xì)cav-1含量(4.610±0.193)降低。研究結(jié)論MiRNA199a-5p在慢性氧化應(yīng)激環(huán)境中可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解和自噬。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54

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