【摘要】：研究背景與意義:心血管疾病導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡是最終引起心功能衰竭的根本原因。預(yù)防心肌細(xì)胞損傷和促進(jìn)心肌再生是理想的措施。近年來關(guān)于心臟干細(xì)胞研究的質(zhì)疑,使得心肌再生的研究陷入了困境。心肌肥厚性生長中,心肌細(xì)胞形成多核多倍體細(xì)胞。而胞質(zhì)分裂障礙是關(guān)鍵原因,其確切機(jī)制尚不清楚。β-catenin是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子。有研究報(bào)道β-catenin能促進(jìn)心肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期,但β-catenin對胞質(zhì)分裂的作用不清楚。本研究著重研究調(diào)控β-catenin對多倍體心肌細(xì)胞胞質(zhì)分裂的作用及可能分子機(jī)制,探索多倍體心肌細(xì)胞在心肌損傷修復(fù)和再生中的作用。研究方法:第一部分:紫紺型與非紫紺型先心病患者心肌細(xì)胞的多倍體情況和細(xì)胞周期情況的差異研究本研究通過新橋醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。2014年10月至2016年10月在新橋醫(yī)院心血管外科的20名符合納入標(biāo)準(zhǔn)并同意參加本研究的患者(10名紫紺型先心病患者和10名非紫紺型先心病患者)納入研究。診斷主要依據(jù)我院術(shù)前心臟彩超結(jié)果或CT結(jié)果,并在術(shù)中證實(shí)。納入標(biāo)準(zhǔn):需行右室流出道疏通術(shù)的先心病患者;四肢血氧飽和度(SpO2)差異≤2%;年齡18歲;排除多次行心臟手術(shù)和其他系統(tǒng)疾病�；颊叻纸M依據(jù)是術(shù)前未氧療時(shí)動脈SpO2。SpO2≥95%的患者為非紫紺組,SpO2≤85%的患者為紫紺組。1.免疫熒光檢測兩組患者心肌細(xì)胞的核數(shù)和橫截面積,pH3陽性、Aurora B陽性和kif20a陽性心肌細(xì)胞的情況。2.流式檢測兩組心肌細(xì)胞倍體數(shù)。第二部分:缺氧調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞周期活性誘導(dǎo)多倍體化的初步機(jī)制研究建立動物缺氧模型:將12只8周大C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為缺氧組(n=6)和常氧組(n=6)。缺氧組小鼠在缺氧倉(氧濃度為9.9%-10.1%)中飼養(yǎng)4周,常氧組在常氧下飼養(yǎng)4周。建立細(xì)胞缺氧模型:原代新生大鼠心肌細(xì)胞分為缺氧組(n=6)和常氧組(n=6)。缺氧組細(xì)胞置于缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(94%N2,5%CO2,1%O2,37℃)培養(yǎng)48h。常氧組細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(74%N2,5%CO2,21%O2,37℃)培養(yǎng)48h。1.免疫熒光比較體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩組心肌細(xì)胞倍體數(shù)、核數(shù)、核倍體數(shù)、多倍體分布情況,以及Ki67陽性、pH3陽性、Aurora B陽性和kif20a陽性心肌細(xì)胞的情況。2.流式檢測體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩組心肌細(xì)胞核的倍體數(shù)。第三部分:缺氧抑制β-catenin的基因調(diào)控活性參與缺氧心肌細(xì)胞多倍體化的機(jī)制研究建立動物缺氧模型和細(xì)胞缺氧模型。處理方法同第一部分。1.生物信息學(xué)分析找出多倍體和二倍體心肌細(xì)胞的差異基因,并進(jìn)行GO分析和KEGG分析,找出可能的關(guān)鍵調(diào)控基因。2.Western Blot(WB)檢測臨床標(biāo)本、體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的兩組β-catenin和HIF-1α的在胞核和胞漿的表達(dá)情況。免疫熒光驗(yàn)證β-catenin在胞核水平的變化。3.RT-qPCR檢測體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩組β-catenin下游靶基因cyclin d1的轉(zhuǎn)錄情況。4.免疫共沉淀檢測體外實(shí)驗(yàn)缺氧組β-catenin,HIF-1α和TCF4三者的相互作用。第四部分:活化的β-catenin調(diào)控心肌細(xì)胞細(xì)胞周期活性促進(jìn)心肌細(xì)胞二倍體化的初步研究建立動物干預(yù)模型:將18只8周大C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為激動劑組(n=6),抑制劑組(n=6)和對照組(n=6)。在缺氧3周后,根據(jù)缺氧倉內(nèi)小鼠體重,每天分別給激動劑組、抑制劑組和對照組小鼠腹腔內(nèi)注射2 mg/kg的激動劑CHIR99021,1.75mg/kg的抑制劑IWR-1和等體積的DMSO,注射一周。建立細(xì)胞干預(yù)模型:按照感染復(fù)數(shù)為10計(jì)算合適的病毒量,將過表達(dá)腺病毒Adβ-catenin(過表達(dá)組),沉默腺病毒Adshβ-catenin(沉默組),空腺病毒AdGFP(對照組)轉(zhuǎn)染至原代新生大鼠心肌細(xì)胞,再缺氧48h。1.WB檢測β-catenin在胞核和胞漿的含量變化,驗(yàn)證體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)效果。RT-qPCR檢測β-catenin下游靶基因的轉(zhuǎn)錄情況。2.免疫熒光比較體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞倍體數(shù)、核數(shù)、核倍體數(shù)和多倍體分布情況、心肌細(xì)胞橫截面積,以及Ki67陽性、pH3陽性、Aurora B陽性和kif20a陽性心肌細(xì)胞的情況。3.流式檢測體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞核的倍體數(shù)。4.CCK8和心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)分別檢測體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞數(shù)量變化。5.小動物心導(dǎo)管檢測小鼠心臟功能變化。第五部分:活化的β-catenin上調(diào)ECT2促進(jìn)四倍體心肌細(xì)胞胞質(zhì)分裂參與心肌再生的機(jī)制研究建立動物干預(yù)模型和細(xì)胞干預(yù)模型。處理參照第四部分。1.WB和RT-qPCR分別檢測Ect2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。2.生物信息學(xué)預(yù)測Ect2非編碼區(qū)上TCF4的結(jié)合位點(diǎn),染色體免疫共沉淀-qPCR(ChIP-qPCR)驗(yàn)證TCF4在Ect2非編碼區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。3.免疫熒光檢測ECT2,Anillin和MgcRacGAP三者的定位情況,明確ECT2對Anillin的作用。4.流式檢測分選的四倍體心肌細(xì)胞的倍體數(shù)。研究結(jié)果:第一部分:紫紺型與非紫紺型先心病患者心肌細(xì)胞的多倍體情況和細(xì)胞周期情況的差異研究1.收集患者的一般情況:非紫紺組(4名男性,6名女性)性別組成和紫紺組(5名男性,5名女性)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。紫紺組年齡(6.65±8.83歲)和非紫紺組(3.52±3.6歲)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。非紫紺組血氧飽和度高于紫紺組(97.50±1.63%vs 68.57±11.37%,P0.05)2.紫紺組心肌細(xì)胞的平均細(xì)胞核數(shù)多于非紫紺組(1.29±0.20 vs 1.03±0.01,P0.05);紫紺組心肌細(xì)胞的平均倍體數(shù)多于非紫紺組(3.61±0.03c vs 2.28±0.18c,P0.05);紫紺組心肌細(xì)胞的平均核倍體數(shù)大于非紫紺組(2.34±0.09c vs 2.04±0.05c,P0.05);紫紺組心肌細(xì)胞的橫截面積大于非紫紺組(相對于非紫紺組的相對面積1.64±0.10 vs 0.98±0.10,P0.05)。3.紫紺組pH3陽性心肌細(xì)胞比例高于非紫紺組(11.38±2.41%vs 2.64±1.69%,P0.05);紫紺組Aurora B陽性心肌細(xì)胞比例與非紫紺組無明顯差異(0.38±0.44%vs0.10±0.25%,P0.05);紫紺組kif20a陽性心肌細(xì)胞比例與非紫紺組無明顯差異(0.19±0.24%vs 0.44±0.36%,P0.05)。第二部分:缺氧調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞周期活性誘導(dǎo)多倍體化的初步機(jī)制研究1.動物缺氧實(shí)驗(yàn)的情況:缺氧組心臟重量與體重比值大于常氧組(5.22±0.48 vs4.38±0.08 mg/g,P0.05),而心臟重量與脛骨長度比值小于常氧組(3.63±0.32 vs 4.73±0.42 mg/mm,P0.05)。缺氧組肺臟重量與體重的比值大于常氧組(9.44±0.33 vs 6.01±0.14 mg/g,P0.05),肺臟重量與脛骨長度的比值與常氧組無明顯差異(6.55±0.21 vs 6.48±0.58 mg/mm,P0.05)。2.動物缺氧實(shí)驗(yàn)中,缺氧組心肌細(xì)胞的平均細(xì)胞核數(shù)多于常氧組(2.04±0.09 vs1.64±0.09,P0.05);缺氧組心肌細(xì)胞的平均倍體數(shù)多于常氧組(4.96±0.37c vs 3.40±0.47c,P0.05);缺氧組心肌細(xì)胞的平均核倍體數(shù)多于常氧組(2.96±0.05c vs 2.48±0.04c,P0.05)。缺氧組心肌細(xì)胞的橫截面積比常氧組大(相對于常氧組的相對面積1.91±0.28 vs 0.95±0.25,P0.05);缺氧組Ki67陽性心肌細(xì)胞比例高于常氧組(5.15±1.78%vs 1.04±1.61%,P0.05);缺氧組pH3陽性心肌細(xì)胞比例高于常氧組(1.28±0.56%vs 0±0%,P0.05);缺氧組Aurora B陽性心肌細(xì)胞比例與常氧組無明顯差異(0±0%vs 1.87±3.23%,P0.05);缺氧組kif20a陽性心肌細(xì)胞比例與常氧組無明顯差異(0.45±0.91%vs 0.93±1.07%,P0.05)。3.細(xì)胞缺氧實(shí)驗(yàn)中,缺氧組心肌細(xì)胞的平均細(xì)胞核數(shù)多于常氧組(1.16±0.06 vs1.04±0.03,P0.05);缺氧組心肌細(xì)胞的平均倍體數(shù)多于常氧組(6.05±0.71c vs 4.55±0.19c,P0.05);缺氧組心肌細(xì)胞的平均核倍體數(shù)多于常氧組(2.20±0.07c vs 2.02±0.03c,P0.05)。缺氧組心肌細(xì)胞的橫截面積比常氧組大(相對于常氧組的相對面積1.61±0.23 vs 1.00±0.10,P0.05);缺氧組Ki67陽性心肌細(xì)胞比例高于常氧組(18.81±11.37%vs 6.99±3.32%,P0.05);缺氧組pH3陽性心肌細(xì)胞比例高于常氧組(6.67±4.3%0 vs 2.29±2.47%,P0.05);缺氧組Aurora B陽性心肌細(xì)胞比例與常氧組無明顯差異(0±0%vs 0.55±1.75%,P0.05);缺氧組kif20a陽性心肌細(xì)胞比例與常氧組無明顯差異(0±0%vs 0.28±0.85%,P0.05)。第三部分:缺氧抑制β-catenin的基因調(diào)控活性參與缺氧心肌細(xì)胞多倍體化的機(jī)制研究1.多倍體心肌細(xì)胞與二倍體比有420個差異基因,功能集中在細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂。β-catenin調(diào)控約1/5的細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂的基因。2.臨床標(biāo)本上,紫紺組胞核內(nèi)β-catenin的含量高于非紫紺組(0.74±0.17 vs 0.42±0.12,P0.05);紫紺組胞核內(nèi)HIF-1α的含量高于非紫紺組(0.71±0.06 vs 0.33±0.05,P0.05)。3.動物缺氧實(shí)驗(yàn)中,缺氧組胞核內(nèi)β-catenin的含量高于常氧組(2.86±0.57 vs 0.98±0.29,P0.05);缺氧組胞核內(nèi)HIF-1α的含量高于常氧組(2.79±0.96 vs 0.82±0.53,P0.05);缺氧組Cyclin D1轉(zhuǎn)錄水平與常氧組無明顯差異(0.85±0.25 vs 1.01±0.08,P0.05)。4.細(xì)胞缺氧實(shí)驗(yàn)中,缺氧組胞核內(nèi)β-catenin的含量高于常氧組(1.04±0.11 vs 0.43±0.19,P0.05);免疫熒光提示β-catenin定位在胞核。缺氧組Cyclin D1轉(zhuǎn)錄水平與常氧組無明顯差異(0.92±0.11 vs 1.01±0.11,P0.05)。5.缺氧下,β-catenin與HIF-1α的結(jié)合比與TCF4明顯(相對于HIF-1α結(jié)合組的灰度值1.00±0.16 vs 0.37±0.09,P0.05)。第四部分:活化的β-catenin調(diào)控心肌細(xì)胞細(xì)胞周期活性促進(jìn)心肌細(xì)胞二倍體化的初步研究1.在體外實(shí)驗(yàn),β-catenin過表達(dá)組核內(nèi)β-catenin含量高于β-catenin沉默組和對照組(1.20±0.11 vs 0.53±0.08 vs 0.77±0.10,P0.05);β-catenin過表達(dá)組Cyclin D1轉(zhuǎn)錄水平高于β-catenin沉默組和對照組(4.53±0.90 vs 1.19±0.40 vs 0.97±0.13,P0.05)。2.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn),β-catenin激動劑組核內(nèi)β-catenin含量高于β-catenin抑制劑組和對照組(1.17±0.10 vs 0.85±0.21 vs 0.71±0.12,P0.05);β-catenin激動劑組Cyclin D1轉(zhuǎn)錄水平高于β-catenin抑制劑組和對照組(3.72±0.45 vs 0.99±0.30 vs 1.15±0.25,P0.05)。3.在體外實(shí)驗(yàn),β-catenin過表達(dá)組心肌細(xì)胞的平均細(xì)胞核數(shù)低于β-catenin沉默組和對照組(1.07±0.04 vs 1.25±0.09 vs 1.22±0.09,P0.05);β-catenin過表達(dá)組心肌細(xì)胞的平均倍體數(shù)低于β-catenin沉默組和對照組(2.33±0.05c vs 4.77±0.09c vs 4.01±0.12c,P0.05);β-catenin過表達(dá)組心肌細(xì)胞的平均核倍體數(shù)低于β-catenin沉默組和對照組(2.02±0.03c vs 2.23±0.08c vs 2.19±0.14c,P0.05);β-catenin過表達(dá)組心肌細(xì)胞的大小與對照組沒有明顯區(qū)別(0.91±0.29 vs 1.73±0.41 vs 0.99±0.08,P0.05);β-catenin過表達(dá)組Ki67陽性心肌細(xì)胞比例高于β-catenin沉默組和對照組(48.14±19.07%vs 4.34±4.86%vs 8.23±6.38%,P0.05);β-catenin過表達(dá)組p H3陽性心肌細(xì)胞比例高于β-catenin沉默組和對照組(35.92±12.89%vs 2.30±2.97%vs 3.95±4.60%,P0.05);β-catenin過表達(dá)組Aurora B陽性心肌細(xì)胞比例高于β-catenin沉默組和對照組(8.27±3.64%vs 1.46±2.70%vs 0.33±0.98%,P0.05);β-catenin過表達(dá)組kif20a陽性心肌細(xì)胞比例高于β-catenin沉默組和對照組(4.26±1.08%vs 0.24±0.68%vs 0.18±0.52%,P0.05);β-catenin過表達(dá)組心肌細(xì)胞數(shù)量多于β-catenin沉默組和對照組(CCK8的OD為0.82±0.06 vs 0.68±0.03 vs 0.66±0.03,P0.05)。4.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn),β-catenin激動劑組心肌細(xì)胞的平均細(xì)胞核數(shù)低于β-catenin抑制劑組和對照組(1.96±0.06 vs 2.13±0.07 vs 2.15±0.17,P0.05);β-catenin激動劑組心肌細(xì)胞的平均倍體數(shù)低于β-catenin抑制劑組和對照組(4.69±0.61c vs 6.19±0.61c vs 6.19±0.59c,P0.05);β-catenin激動劑組心肌細(xì)胞的平均核倍體數(shù)低于β-catenin抑制劑組和對照組(2.38±0.07c vs 2.61±0.10c vs 2.91±0.10c,P0.05);β-catenin激動劑組心肌細(xì)胞的大小與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.77±0.13 vs 1.12±0.17 vs 1.12±0.23,P0.05);β-catenin激動劑組Ki67陽性心肌細(xì)胞比例高于β-catenin抑制劑組和對照組(17.16±3.43%vs 5.04±1.00%vs 2.95±2.76%,P0.05);β-catenin激動劑組p H3陽性心肌細(xì)胞比例高于β-catenin抑制劑組和對照組(32.51±13.27%vs 12.78±5.93%vs6.44±3.57%,P0.05);β-catenin激動劑組Aurora B陽性心肌細(xì)胞比例高于β-catenin抑制劑組和對照組(1.90±0.15%vs 0±0%vs 0±0%,P0.05);β-catenin激動劑組kif20a陽性心肌細(xì)胞比例高于β-catenin抑制劑組和對照組(1.42±0.34%vs 0±0%vs 0±0%,P0.05);β-catenin激動劑組心肌細(xì)胞數(shù)量多于β-catenin抑制劑組和對照組(12.80±1.10*106 vs 9.80±0.41*106 vs 10.53±0.22*106,P0.05);β-catenin激動劑組心臟射血分?jǐn)?shù)高于β-catenin抑制劑組和對照組(58.15±3.19%vs 45.04±3.23%vs53.22±2.23%,P0.05)。第五部分:活化的β-catenin上調(diào)ECT2促進(jìn)四倍體心肌細(xì)胞胞質(zhì)分裂參與心肌再生的機(jī)制研究1.體外實(shí)驗(yàn)中,β-catenin過表達(dá)組胞核內(nèi)ECT2含量高于β-catenin沉默組和對照組(1.42±0.15 vs 0.34±0.02 vs 0.13±0.02,P0.05);體外實(shí)驗(yàn)中,β-catenin過表達(dá)組ECT2轉(zhuǎn)錄水平高于β-catenin沉默組和對照組(2.87±0.33 vs 0.79±0.13 vs 1.05±0.18,P0.05);體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,β-catenin激動劑組胞核內(nèi)ECT2含量高于β-catenin抑制劑組和對照組(1.99±0.17 vs 1.16±0.06 vs 0.85±0.12,P0.05);體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,β-catenin激動劑組ECT2轉(zhuǎn)錄水平高于β-catenin抑制劑組和對照組(3.03±0.52 vs 0.92±0.46 vs1.02±0.18,P0.05)。2.TCF4在Ect2第一內(nèi)含子內(nèi)有結(jié)合位點(diǎn)。3.體外實(shí)驗(yàn)中,β-catenin過表達(dá)組ECT2與Anillin共定位于肌動蛋白收縮環(huán)的比例高于β-catenin沉默組和對照組(3.60±4.87%vs 0±0%vs 0±0%,P0.05);β-catenin過表達(dá)組ECT2與Mgc Rac GAP共定位于肌動蛋白收縮環(huán)的比例高于β-catenin沉默組和對照組(2.76±3.77%vs 0±0%vs 0±0%,P0.05)。4.在分選的四倍體心肌細(xì)胞,β-catenin激動劑組心肌細(xì)胞平均倍體數(shù)低于對照組(2.93±0.12c vs 2.90±0.07c,P0.05)。研究結(jié)論:1.與非紫紺組比,紫紺組心肌細(xì)胞明顯多倍體化,以多核化為主;心肌細(xì)胞的S期活性增高,G2/M期和胞質(zhì)分裂活性無明顯增高。2.缺氧情況下,β-catenin入胞核,與HIF-1α結(jié)合,β-catenin活性受到抑制,進(jìn)而引起心肌細(xì)胞的G1/S期活性增加,而不改變G2/M期和胞質(zhì)分裂活性,誘導(dǎo)多核多倍體心肌細(xì)胞產(chǎn)生。3.缺氧情況下,活化的β-catenin通過上調(diào)ECT2,促進(jìn)ECT2與Anillin結(jié)合,正確定位于肌動蛋白收縮環(huán),促進(jìn)多倍體心肌細(xì)胞胞質(zhì)分裂。
【圖文】：

的分子機(jī)制（見圖 1.1）。在第二章中，通過比較紫紺型先心病患者與非紫紺患者倍體數(shù)、核數(shù)和細(xì)胞周期活性，并初步探討相關(guān)機(jī)制。在第三章中，通離體的心肌細(xì)胞和在體小鼠心肌進(jìn)行干預(yù)，觀察倍體數(shù)、核數(shù)和細(xì)胞周期活步確認(rèn)缺氧對心肌細(xì)胞多倍體化的誘導(dǎo)作用及初步誘導(dǎo)機(jī)制。第四章節(jié)，通息學(xué)分析篩選促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的蛋白，發(fā)現(xiàn) β-catenin 可能具有促進(jìn)心肌細(xì)作用，進(jìn)一步探討其在缺氧過程中活性抑制的分子機(jī)制。第五章中，通過atenin 活性，觀察慢性缺氧下心肌細(xì)胞倍體數(shù)、核數(shù)和細(xì)胞周期活性的變化，atenin 對心肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步探討 β-catenin 與心肌細(xì)胞胞質(zhì)分裂。在第六章中，通過增加四倍體心肌細(xì)胞的 β-catenin 活性，觀察四倍體心肌、核數(shù)和胞質(zhì)分裂的情況，進(jìn)一步探索 β-catenin 與心肌細(xì)胞胞質(zhì)分裂的關(guān)鍵llin 和 ECT2 蛋白三者之間的調(diào)控關(guān)系，最終確認(rèn) β-catenin 影響多倍體心肌細(xì)裂的分子機(jī)制。

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文Ki67 陽性和 pH3 陽性的心肌細(xì)胞核，是在共聚焦顯微鏡用層掃技術(shù)拍照后，細(xì)所在的平面上 Ki67 陽性和 pH3 陽性分別與心肌細(xì)胞核信號共定位。Aurora B 陽 kif20a 陽性的心肌細(xì)胞核，是相鄰兩細(xì)胞核所在的平面上 Aurora B 陽性和 kif2性信號分別定位兩個心肌細(xì)胞核信號之間。心肌細(xì)胞核，是細(xì)胞核信號完全被包裹在 Troponin T 抗體信號之內(nèi)，且未與 WG記的細(xì)胞膜信號相鄰[26]（見圖 2.1）。由 WGA 染色標(biāo)記的細(xì)胞膜信號包裹的 Troponin T 陽性的細(xì)胞是心肌細(xì)胞，，WG號包圍的面積為心肌細(xì)胞大小。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54


本文編號：2701574