【摘要】：目的:肢體缺血后,肌衛(wèi)星細(xì)胞(Myosatellite cells,SCs)通過成肌分化過程,參與修復(fù)損傷的骨骼肌。而缺血后的氧化應(yīng)激反應(yīng)是影響肌肉損傷和修復(fù)的主要因素,減少氧化應(yīng)激反應(yīng)可能成為缺血肢體治療的重要策略。原花青素(Proanthocyanidins,PC)具有抗氧化和清除自由基的作用,在肌肉缺血損傷與修復(fù)中發(fā)揮著保護(hù)作用,但是原花青素的具體保護(hù)機(jī)制尚未闡明。微小RNAs(miRNAs)是一類小的非編碼的單鏈核苷酸序列,主要與靶mRNA結(jié)合起負(fù)性調(diào)控作用。肌源性miRNAs與肌肉損傷后肌纖維的再生過程密切相關(guān),而其是否參與原花青素對缺血骨骼肌的作用及具體機(jī)制尚不明確。因此本研究通過構(gòu)建簡單且穩(wěn)定的后肢缺血(Hind limb ischemia,HLI)小鼠模型,探究原花青素對缺血肌肉的作用,篩選miRNAs的表達(dá)譜變化,研究差異表達(dá)miRNA的功能,初步探討miRNAs在原花青素與下肢肌肉缺血過程中的作用。第一部分,方法:32只10-12周齡的雄性C57/BL6小鼠,隨機(jī)平均分為4組。通過結(jié)扎不同位點(diǎn),建立后肢缺血模型:1)雙重結(jié)扎并離斷左側(cè)股動脈的起點(diǎn)和遠(yuǎn)端分叉處(移行為乆動脈和隱動脈),根據(jù)經(jīng)典文獻(xiàn)方法建立model-1,并作為對照組;2)只雙重結(jié)扎并離斷股動脈遠(yuǎn)端分叉處,參照文獻(xiàn)建立model-2的模型方法;3)只雙重結(jié)扎并離斷旋髂淺動脈與股深動脈之間的股動脈,以建立新的model-3方法;4)結(jié)扎離斷近端的旋髂淺動脈與股深動脈間的股動脈,和股動脈的遠(yuǎn)端分叉處。建立另一種新的model-4后肢缺血方法。通過激光多普勒儀評估術(shù)后缺血肢體的血流灌注恢復(fù)情況,并使用運(yùn)動機(jī)能評分評估缺血肢體運(yùn)動功能障礙的恢復(fù)情況。收集缺血側(cè)腓腸肌進(jìn)行石蠟包埋切片,然后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,計算再生肌纖維(中心核型)占所有肌纖維的比例,以評估缺血程度對骨骼肌再生的影響。使用石蠟切片再進(jìn)行CD31的免疫熒光染色,用于評估缺血程度對新生血管的數(shù)量的影響。結(jié)果:4種模型小鼠的缺血側(cè)肢體的血流灌注水平,均在術(shù)后立即下降超過75%,且無明顯差異。model-2和model-3的血流再灌注和缺血肢體運(yùn)動功能的恢復(fù)速度,均明顯快于model-1(P0.05),但model-4和model-1間無明顯差異。類似的,model-2和model-3的肌肉再生比例明顯低于model-1(P0.05),而model-2的新生血管比例明顯少于model-1(P0.01)。在再生肌纖維比例和血管新生比例方面,model-4與model-1無明顯差異。結(jié)論:Model-4的造模方法可得到類似于model-1的后肢缺血模型,而構(gòu)建模型的難度相對簡單。第二部分,方法:通過對不同模型方法的研究,model-1的HLI模型使用廣泛且重復(fù)性良好,故選為本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头椒?取36只C57/BL6雄性小鼠構(gòu)建左后肢缺血小鼠模型后,隨機(jī)分為3個組:對照組(H_2O)、低濃度原花青素(low dose PC,LDPC)組(1 mg/kg)和高濃度原花青素(high dose PC,HDPC)組(20 mg/kg)。進(jìn)行激光多普勒掃描,并記錄缺血肢體的運(yùn)動評分。在術(shù)后第7天和21天采集后腔靜脈血漿和缺血側(cè)腓腸肌(Gastrocnemius muscle,GC)。將血漿和缺血腓腸肌通過硫代巴比妥酸(TBARS)法測定脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量;腓腸肌HE染色后顯微鏡計數(shù)再生肌纖維占所有肌纖維的比例。取造模術(shù)后第7天的對照組和高濃度組的小鼠缺血側(cè)腓腸肌,基因芯片檢測miRNAs的表達(dá)譜;然后進(jìn)行實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測mmu-miR-133b-3p的表達(dá)變化。通過TargetScan和miRanda兩個miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫,通過尋找共同交集的方法,找到mmu-miR-133b-3p的預(yù)測靶基因集合。對該集合進(jìn)行Gene Ontology和KEGG pathway分析,并納入STRING分析蛋白間的相互作用,排除無聯(lián)系的靶蛋白。最后蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)測定轉(zhuǎn)錄因子Pax7(Paired-box 7)、成肌分化抗原D(MyoD)、絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(MKP1)、P38-MAPK和磷酸化P38-MAPK的表達(dá)變化(以GAPDH為內(nèi)參蛋白)。結(jié)果:高濃度PC組的缺血肢體運(yùn)動機(jī)能恢復(fù)速度明顯快于對照組和低濃度組(P0.05),低濃度組和對照組無顯著差別。高濃度PC組血漿和肌肉MDA含量在7天時與另兩組相比均明顯降低(P0.05),21天時三組間并無統(tǒng)計學(xué)差異。缺血肌肉的再生肌纖維比例在7天和21天時均明顯高于另外兩組(P0.05)。通過基因芯片篩選出8個差異表達(dá)的miRNAs,其中mmu-mi R-133b-3p表達(dá)差異大,且豐度高。相對于對照組,高濃度組的缺血腓腸肌中miR-133b-3p表達(dá)上調(diào),而PPP2CA、PPP2CB和MKP1可能是miR-133b的靶基因。Western印跡檢測發(fā)現(xiàn),Pax7和MKP1表達(dá)下調(diào),MyoD和p-P38-MAPK的表達(dá)升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1)原花青素可降低肢體缺血后的氧化應(yīng)激水平,并促進(jìn)肌纖維的再生;2)原花青素在促進(jìn)肌纖維再生過程中,可能通過促進(jìn)miR-133b-3p的表達(dá),經(jīng)MKP1/P38-MAPK信號通路軸發(fā)揮調(diào)控作用。
【圖文】：

mg/kg）控制術(shù)后疼痛。每只小鼠的造模過程控制在 10 min 內(nèi)完成。6) 術(shù)后小鼠置于恒溫加熱臺復(fù)蘇，30 min 后再行激光多普勒掃描。3.1.2 不同結(jié)扎位點(diǎn)（圖 1）1) model-1 采用經(jīng)典[36]后肢缺血模型結(jié)扎位點(diǎn)：股動脈起點(diǎn)（旋髂淺動脈近端）和股動脈遠(yuǎn)點(diǎn)（乆隱動脈分叉處間）。將 model-1 作為對照組。2) model-2 使用 Limbourg 等[35]的方法：只結(jié)扎股動脈遠(yuǎn)點(diǎn)。3) model-3 的結(jié)扎點(diǎn)為：旋髂淺動脈與股深動脈之間的股動脈。4) model-4 綜合取 model-2 和 model-3 的結(jié)扎點(diǎn)即是：旋髂淺動脈與股深動脈之間的股動脈和股動脈遠(yuǎn)點(diǎn)。術(shù)后均使用激光多普勒儀評估缺血后肢血流恢復(fù)情況，并使用運(yùn)動功能評分評估運(yùn)動功能恢復(fù)情況，比較 4 種模型間的差異。

西 南 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文結(jié) 果股動脈的解剖結(jié)構(gòu)主要由股動脈供血，股動脈是髂外動脈經(jīng)腹股段自上而下分別分支為：旋髂淺動脈主要供；股深動脈主要為大腿內(nèi)側(cè)群、后側(cè)群肌肉股深動脈起點(diǎn)附近分支而來，，為腹壁側(cè)肌肉動脈在膝關(guān)節(jié)上方分叉為隱動脈和乆動脈，分叉處之間發(fā)出，位置不甚恒定（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543

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本文編號：2696476