【摘要】：目的:肢體缺血后,肌衛(wèi)星細胞(Myosatellite cells,SCs)通過成肌分化過程,參與修復損傷的骨骼肌。而缺血后的氧化應激反應是影響肌肉損傷和修復的主要因素,減少氧化應激反應可能成為缺血肢體治療的重要策略。原花青素(Proanthocyanidins,PC)具有抗氧化和清除自由基的作用,在肌肉缺血損傷與修復中發(fā)揮著保護作用,但是原花青素的具體保護機制尚未闡明。微小RNAs(miRNAs)是一類小的非編碼的單鏈核苷酸序列,主要與靶mRNA結(jié)合起負性調(diào)控作用。肌源性miRNAs與肌肉損傷后肌纖維的再生過程密切相關(guān),而其是否參與原花青素對缺血骨骼肌的作用及具體機制尚不明確。因此本研究通過構(gòu)建簡單且穩(wěn)定的后肢缺血(Hind limb ischemia,HLI)小鼠模型,探究原花青素對缺血肌肉的作用,篩選miRNAs的表達譜變化,研究差異表達miRNA的功能,初步探討miRNAs在原花青素與下肢肌肉缺血過程中的作用。第一部分,方法:32只10-12周齡的雄性C57/BL6小鼠,隨機平均分為4組。通過結(jié)扎不同位點,建立后肢缺血模型:1)雙重結(jié)扎并離斷左側(cè)股動脈的起點和遠端分叉處(移行為乆動脈和隱動脈),根據(jù)經(jīng)典文獻方法建立model-1,并作為對照組;2)只雙重結(jié)扎并離斷股動脈遠端分叉處,參照文獻建立model-2的模型方法;3)只雙重結(jié)扎并離斷旋髂淺動脈與股深動脈之間的股動脈,以建立新的model-3方法;4)結(jié)扎離斷近端的旋髂淺動脈與股深動脈間的股動脈,和股動脈的遠端分叉處。建立另一種新的model-4后肢缺血方法。通過激光多普勒儀評估術(shù)后缺血肢體的血流灌注恢復情況,并使用運動機能評分評估缺血肢體運動功能障礙的恢復情況。收集缺血側(cè)腓腸肌進行石蠟包埋切片,然后進行蘇木素-伊紅(HE)染色,計算再生肌纖維(中心核型)占所有肌纖維的比例,以評估缺血程度對骨骼肌再生的影響。使用石蠟切片再進行CD31的免疫熒光染色,用于評估缺血程度對新生血管的數(shù)量的影響。結(jié)果:4種模型小鼠的缺血側(cè)肢體的血流灌注水平,均在術(shù)后立即下降超過75%,且無明顯差異。model-2和model-3的血流再灌注和缺血肢體運動功能的恢復速度,均明顯快于model-1(P0.05),但model-4和model-1間無明顯差異。類似的,model-2和model-3的肌肉再生比例明顯低于model-1(P0.05),而model-2的新生血管比例明顯少于model-1(P0.01)。在再生肌纖維比例和血管新生比例方面,model-4與model-1無明顯差異。結(jié)論:Model-4的造模方法可得到類似于model-1的后肢缺血模型,而構(gòu)建模型的難度相對簡單。第二部分,方法:通過對不同模型方法的研究,model-1的HLI模型使用廣泛且重復性良好,故選為本部分實驗模型方法:取36只C57/BL6雄性小鼠構(gòu)建左后肢缺血小鼠模型后,隨機分為3個組:對照組(H_2O)、低濃度原花青素(low dose PC,LDPC)組(1 mg/kg)和高濃度原花青素(high dose PC,HDPC)組(20 mg/kg)。進行激光多普勒掃描,并記錄缺血肢體的運動評分。在術(shù)后第7天和21天采集后腔靜脈血漿和缺血側(cè)腓腸肌(Gastrocnemius muscle,GC)。將血漿和缺血腓腸肌通過硫代巴比妥酸(TBARS)法測定脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量;腓腸肌HE染色后顯微鏡計數(shù)再生肌纖維占所有肌纖維的比例。取造模術(shù)后第7天的對照組和高濃度組的小鼠缺血側(cè)腓腸肌,基因芯片檢測miRNAs的表達譜;然后進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測mmu-miR-133b-3p的表達變化。通過TargetScan和miRanda兩個miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫,通過尋找共同交集的方法,找到mmu-miR-133b-3p的預測靶基因集合。對該集合進行Gene Ontology和KEGG pathway分析,并納入STRING分析蛋白間的相互作用,排除無聯(lián)系的靶蛋白。最后蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)測定轉(zhuǎn)錄因子Pax7(Paired-box 7)、成肌分化抗原D(MyoD)、絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(MKP1)、P38-MAPK和磷酸化P38-MAPK的表達變化(以GAPDH為內(nèi)參蛋白)。結(jié)果:高濃度PC組的缺血肢體運動機能恢復速度明顯快于對照組和低濃度組(P0.05),低濃度組和對照組無顯著差別。高濃度PC組血漿和肌肉MDA含量在7天時與另兩組相比均明顯降低(P0.05),21天時三組間并無統(tǒng)計學差異。缺血肌肉的再生肌纖維比例在7天和21天時均明顯高于另外兩組(P0.05)。通過基因芯片篩選出8個差異表達的miRNAs,其中mmu-mi R-133b-3p表達差異大,且豐度高。相對于對照組,高濃度組的缺血腓腸肌中miR-133b-3p表達上調(diào),而PPP2CA、PPP2CB和MKP1可能是miR-133b的靶基因。Western印跡檢測發(fā)現(xiàn),Pax7和MKP1表達下調(diào),MyoD和p-P38-MAPK的表達升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1)原花青素可降低肢體缺血后的氧化應激水平,并促進肌纖維的再生;2)原花青素在促進肌纖維再生過程中,可能通過促進miR-133b-3p的表達,經(jīng)MKP1/P38-MAPK信號通路軸發(fā)揮調(diào)控作用。
【圖文】：

mg/kg）控制術(shù)后疼痛。每只小鼠的造模過程控制在 10 min 內(nèi)完成。6) 術(shù)后小鼠置于恒溫加熱臺復蘇，30 min 后再行激光多普勒掃描。3.1.2 不同結(jié)扎位點（圖 1）1) model-1 采用經(jīng)典[36]后肢缺血模型結(jié)扎位點：股動脈起點（旋髂淺動脈近端）和股動脈遠點（乆隱動脈分叉處間）。將 model-1 作為對照組。2) model-2 使用 Limbourg 等[35]的方法：只結(jié)扎股動脈遠點。3) model-3 的結(jié)扎點為：旋髂淺動脈與股深動脈之間的股動脈。4) model-4 綜合取 model-2 和 model-3 的結(jié)扎點即是：旋髂淺動脈與股深動脈之間的股動脈和股動脈遠點。術(shù)后均使用激光多普勒儀評估缺血后肢血流恢復情況，并使用運動功能評分評估運動功能恢復情況，比較 4 種模型間的差異。

西 南 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文結(jié) 果股動脈的解剖結(jié)構(gòu)主要由股動脈供血，股動脈是髂外動脈經(jīng)腹股段自上而下分別分支為：旋髂淺動脈主要供；股深動脈主要為大腿內(nèi)側(cè)群、后側(cè)群肌肉股深動脈起點附近分支而來，，為腹壁側(cè)肌肉動脈在膝關(guān)節(jié)上方分叉為隱動脈和乆動脈，分叉處之間發(fā)出，位置不甚恒定（圖 2）。
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R543

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 崔夢晗;陳曉旭;王宇琦;韓雪;謝鳳英;孫立娜;;黑米原花青素的紅外光譜分析[J];食品科技;2019年04期

2 林小柯;楊伊莉;葛彬潔;吳佳紅;高紅;茅范心;;組織破碎法提取蓮蓬中的原花青素工藝研究[J];食品安全導刊;2019年12期

3 毛雪;張養(yǎng)灼;劉玉梅;;葡萄枝蔓中原花青素的提取分離及其抗氧化活性研究[J];保鮮與加工;2018年01期

4 陳夢雨;黃小丹;王釗;龍丹鳳;張珂;王玉;;植物原花青素的研究進展及其應用現(xiàn)狀[J];中國食物與營養(yǎng);2018年03期

5 關(guān)亞飛;陳媛媛;馮年捷;周夢舟;汪超;吳茜;;原花青素金屬配合物合成、表征以及抗氧化性的探究[J];中國調(diào)味品;2018年08期

6 徐歆;姚其鳳;祝琳;徐琪;吳正奇;陳小強;;紫娟茶原花青素的組分及活性評價[J];食品工業(yè)科技;2018年21期

7 徐明璐;徐文遠;劉文;季慧;戴明濤;譚舉慶;;原花青素研究進展[J];煙臺果樹;2017年01期

8 顏培;張璐;徐珊珊;;原花青素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護作用的研究進展[J];中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥;2017年07期

9 張朝;唐志書;劉紅波;;沙棘原花青素的提取、純化及藥理學研究進展[J];中南藥學;2017年07期

10 李茜;關(guān)亞飛;丁城;汪超;吳茜;;蓮原花青素與金屬離子配合率的測定[J];食品科技;2017年10期

相關(guān)會議論文 前10條

1 秦永劍;張加研;;云南松多聚原花青素的化學降解工藝研究[A];第九屆中國林業(yè)青年學術(shù)年會論文摘要集[C];2010年

2 叢建波;陳言詳;王長振;先宏;吳可;;一種植物原花青素的抗氧化能力觀察[A];第十一次中國生物物理學術(shù)大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

3 曹生亞;潘陽;商亮;曹佳;杜芬;喻紅;;原花青素抗動脈粥樣硬化機制的初步研究[A];第11屆全國脂質(zhì)與脂蛋白學術(shù)會議論文匯編[C];2012年

4 張立實;;花青素和原花青素的生物學作用研究進展[A];全國公共衛(wèi)生與食物營養(yǎng)高層論壇暨中國營養(yǎng)學會與保健食品分會第四屆學術(shù)研討會論文集[C];2006年

5 張俊鴿;李平華;;原花青素抗晶狀體氧化損傷的實驗研究[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術(shù)大會論文匯編[C];2007年

6 楊艷杰;李書藝;祝振洲;何靜仁;;生物酶輔助物理場高效提取荔枝原花青素[A];中國生物工程學會第二屆青年科技論壇暨首屆青年工作委員會學術(shù)年會摘要集[C];2017年

7 鄧宇;徐兆發(fā);劉巍;楊海波;陳杰;蘇賢;徐斌;;番茄紅素和原花青素對汞致大鼠肝損傷影響的實驗研究[A];全國生化/工業(yè)與衛(wèi)生毒理學學術(shù)會議論文集[C];2010年

8 朱振勤;陳季武;翟萬銀;夏晶;謝萍;;葡萄原花青素清除自由基能力以及對離體培養(yǎng)小牛主動脈細胞氧化損傷保護功效的研究[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2003年學術(shù)交流會論文摘要集[C];2003年

9 原慧萍;馬春陽;周欣榮;李鴻翼;孫禹;;原花青素對微波誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的拮抗作用[A];中華醫(yī)學會第十二屆全國眼科學術(shù)大會論文匯編[C];2007年

10 高明堂;汪晨凈;時小燕;吳勇杰;李文廣;;原花青素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[A];中國藥理學會第八次全國代表大會暨全國藥理學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 翁國娟;原花青素提取技術(shù)實現(xiàn)突破[N];中國化工報;2013年

2 記者 馮海波 通訊員 周飛 蘇國華;專家從荔枝中提取出原花青素A2[N];廣東科技報;2015年

3 康陽;巧克力的保健作用[N];中國石油報;2003年

4 康陽;巧克力也保健[N];中國醫(yī)藥報;2003年

5 ;人體的除銹劑——原花青素[N];保健時報;2005年

6 董耀平 楊虹;原花青素何時奪“魁”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

7 許國清;開發(fā)出具有我國獨立知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品[N];消費日報;2008年

8 ;葡萄籽提取物原花青素誘導乳腺癌MCF－7細胞脫落凋亡[N];中國醫(yī)藥報;2003年

9 李呈祥　孟慶華;興隆圍繞特色產(chǎn)業(yè)加快經(jīng)濟轉(zhuǎn)型[N];承德日報;2010年

10 中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所研究員　郭伽;巧克力的新功能[N];光明日報;2004年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 齊雅靜;不同結(jié)構(gòu)原花青素的制備及對食品中丙烯酰胺生成的影響[D];江南大學;2019年

2 楚美俊;中國菰米酚類成分及生物活性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2019年

3 李綺麗;蓮子皮低聚原花青素分級分離、組分鑒定與抗氧化機理研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2013年

4 劉睿;高梁外種皮中原花青素及其對小曲白酒揮發(fā)性成分影響機制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2004年

5 段玉清;蓮原花青素對皮膚的保護作用及其分子機制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2004年

6 李春陽;葡萄籽中原花青素的提取純化及其結(jié)構(gòu)和功能研究[D];江南大學;2006年

7 陸茵;胃癌基因表達譜及原花青素癌化學預防機理的研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2001年

8 榮爽;荔枝殼原花青素對動脈粥樣硬化的保護作用及其機制研究[D];華中科技大學;2012年

9 趙繼榮;蘋果種質(zhì)資源果實多酚性狀評價與QTL定位[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2015年

10 敬思群;昆侖雪菊三種有效組分的提取純化及生物活性[D];江南大學;2015年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 徐歆;紫娟茶原花青素分離提純、組分鑒定及腸胃穩(wěn)定性研究[D];湖北工業(yè)大學;2019年

2 付歆欣;原花青素在雌性生殖干細胞增殖和卵巢衰老中的作用研究[D];南昌大學;2019年

3 聶文;食品組分對烤腸中PAHs生成的影響及其抑制研究[D];合肥工業(yè)大學;2019年

4 紀秀鳳;紅樹莓籽中低聚原花青素純化鑒定及其微膠囊化研究[D];渤海大學;2019年

5 井璐珍;不同色澤青稞及發(fā)芽青稞中酚類物質(zhì)的定性定量分析及抗氧化活性研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

6 蘇云霞;板栗殼原花青素提取、分離鑒定及抗氧化活性研究[D];武漢工程大學;2018年

7 張玲玲;原花青素B_2平穩(wěn)餐后血糖作用及其在蕎麥中分布的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

8 何英霞;不同條件下原花青素對鰻鱺幼魚生長性能、血清生化指標及腸道健康的影響[D];集美大學;2019年

9 浦娜娜;白刺果原花青素的提取、純化及抗氧化活性研究[D];齊魯工業(yè)大學;2019年

10 劉瓊;棗原花青素提取純化及抗氧化性研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2018年

本文編號：2696476