【摘要】：目的:動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié),CXC趨化因子配體16(CXCL16)作為黏附分子、趨化因子及清道夫受體參與其中。我們的研究目的在于探索(1)炎性損傷因素脂多糖(LPS)是否影響內(nèi)皮細胞CXCL16表達及其作用途徑;(2)與炎癥及動脈粥樣硬化相關(guān)的miR-146a對LPS誘導的CXCL16表達的調(diào)控及作用機制。方法:采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs),給予LPS炎性刺激,構(gòu)建炎性細胞模型;通過生物信息學網(wǎng)站預測miR-146a作用靶點;通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-146a模擬體(miR-146a mimics)或miR-146a抑制劑(miR-146a inhibitors),過表達或抑制內(nèi)皮細胞中miR-146a表達;通過Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法觀察內(nèi)皮細胞活性變化,免疫熒光觀察細胞轉(zhuǎn)染情況;采用分子生物學技術(shù)酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測細胞上清液中CXCL16表達,蛋白印跡(Western blotting)檢測細胞CXCL16及信號通路分子Toll樣受體4(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)蛋白表達,實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-146a表達水平。結(jié)果:(1)利用濃度梯度(0-10ug/mL)及時間梯度(0-48h)的LPS干預HUVECs,與空白對照組相比,在1、3、10ug/mL(24h)及6、12、24、48h(1ug/mL)內(nèi)皮細胞活性明顯降低(P0.05);CXCL16在LPS濃度1ug/mL時釋放及表達增加,時間越長,內(nèi)皮細胞釋放及表達CXCL16明顯增加(P0.05)。(2)利用LPS誘導HUVECs,檢測信號通路TLR4、phosphor-NF-κB p65、NF-κB p65是否被激活。結(jié)果顯示,TLR4、phosphor-NF-κB p65在1ug/mL LPS濃度下表達明顯增加;在作用時間上,TLR4及phosphor-NF-κB p65均在24小時變化明顯(P0.05)。給予TLR4的抑制劑TAK-242(10uM,12h),阻斷TLR4后,選擇1ug/mL的LPS繼續(xù)干預24小時,與空白組相比,TAK-242抑制劑組TLR4及下游NF-κB表達明顯減少;并且TAK-242抑制劑組,細胞釋放及表達CXCL16相較于空白組明顯降低(P0.05)。(3)利用LPS誘導HUVECs,檢測miR-146a表達。與空白對照相比,LPS能夠誘導miR-146a表達明顯增加(P0.05)。進一步,通過轉(zhuǎn)染上調(diào)及下調(diào)miR-146a表達后,檢測CXCL16的表達變化。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-146a mimics,上調(diào)miR-146a表達后,相較其對照組,CXCL16表達明顯下降;相反的,轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitors,抑制miR-146a作用,CXCL16表達高于其對照組(P0.05)。(4)通過轉(zhuǎn)染上調(diào)及下調(diào)miR-146a后,檢測TLR4及phosphor-NF-κB p65表達。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-146a mimics組,上調(diào)miR-146a表達后,TLR4、phosphor-NF-κB p65表達下降;相反,miR-146a inhibitors組在抑制miR-146a后,TLR4、phosphor-NF-κB p65表達增加。我們在給予TLR4的抑制劑TAK-242(10uM,12小時)基礎(chǔ)上,同時轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitors,檢測TLR4/NF-κB通路,及CXCL16的表達變化。結(jié)果顯示抑制劑TAK-242明顯阻斷了miR-146a inhibitor干預后上清及細胞高表達的CXCL16,并且TLR4、phosphor-NF-κB p65通路蛋白有相同的趨勢(P0.05)。結(jié)論:(1)LPS能夠誘導內(nèi)皮細胞CXCL16釋放及表達增加;(2)LPS通過TLR4/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)HUVECs中CXCL16表達變化;(3)在LPS誘導下HUVECs中,miR-146a表達增加,通過作用于TLR4,負反饋調(diào)控CXCL16的表達。
【圖文】：

（1） 將血球計數(shù)板擦拭干凈，并將蓋玻片置于計數(shù)板上；（2） 制備懸液：按照 2.2.2 中方法進行，鏡下觀察呈單細胞懸液；（3） 將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，注意蓋片下不要有氣泡；（4） 統(tǒng)計：統(tǒng)計計數(shù)板外周 4 格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的；（5） 計算細胞數(shù)：按照公式計算細胞密度：細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×104。2.2.5 細胞活性檢測使用 Cell Counting Kit-8 進行細胞活性檢測，具體步驟參照 Cell Counting Kit-8（MCE）說明書。（1） 在 96 孔板中接種 HUVECs 懸液(100 μL/孔，細胞密度約 6-8×103/mL)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時；（2） 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡)；（3） 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時；（4） 分別在 1、2、3、4h 時使用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度（OD 值）。

圖 2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染鏡下觀察（a 光鏡鏡下圖像，b 同視野熒光顯微鏡鏡下圖像）2.4 分子生物學實驗2.4.1 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）檢測 miR-146a 表達（1）RNA 提取① 細胞裂解：吸取培養(yǎng)基，加冰 PBS 沖洗 2 遍；加 Trizol 裂解液（每 10cm2加入 1mL），輕微研磨混勻處理；② 提取 RNA：將勻漿液移至 EP 管中，加入 200μL 的氯仿（1/5 體積的 Trizol），旋渦振蕩 15 秒，，冰上靜置 10min，待分層； 4℃，12000rpm 離心 15min，勻漿液分至 3 層；③ 沉淀 RNA：取上層上清液，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，冰上靜止 20min；4℃，12000rpm 離心 15min，可見 RNA 沉淀；④ 洗滌 RNA：去除上清，加入等 Trizol 體積的 75%乙醇溶液（DEPC 水 25% + 75%無水乙醇），輕微混勻；4℃，7500rpm 離心 10min，可見 RNA 沉淀；可重復
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R543.5

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6 田

本文編號：2690540