【摘要】：背景:心肌梗死(myocardial infarction,MI)是冠心病(Coronary a rtery disease,CAD)中最常見且主要的一類疾病,其發(fā)病趨勢呈逐年增長,且發(fā)病年齡也漸趨年輕化,已然對人類健康構(gòu)成了不可估量的影響。吸煙、高血壓、高血脂和遺傳等危險因素對CAD的影響已成為國內(nèi)外學者的共識。近年來,對遺傳學逐漸深入認知,全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study,GWAS)發(fā)現(xiàn):有200多個與C AD有關(guān)聯(lián)的染色體基因位點存在。II型溶酶體相關(guān)膜蛋白(Lysosome-associated membrane protein-2,LAMP2)屬于新發(fā)現(xiàn)的抗中性粒細胞胞漿抗體中的一種,其位于性染色體Xq24~Xq25上,編碼LAMP2蛋白,該蛋白在細胞自噬的過程中有著關(guān)鍵作用。在LAMP2缺乏的成纖維細胞中,膽固醇的酯化出現(xiàn)障礙,大部分未進行酯化的膽固醇聚集在晚期的內(nèi)體和溶酶體中,引起了膽固醇聚集的現(xiàn)象,誘發(fā)動脈粥樣硬化斑塊的形成。在CAD患者的外周粒細胞中,LAMP2基因的表達水平升高明顯,引起膽固醇代謝異常,引起動脈粥樣硬化,促使CAD的發(fā)生與發(fā)展。目的:通過研究AMI組病人與健康對照組中LAMP2基因啟動子的序列變異情況,將有變異的基因序列構(gòu)建成pGL3-basic表達載體,通過對熒光素酶的活性進行檢測,分析LAMP2基因表達水平的情況,從而探討LAMP2基因在心肌梗死的發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:1本研究納入324例AMI患者、310例同期健康對照者,分別對兩組人群的臨床基線資料進行統(tǒng)計,并提取其DNA。2參考NCBI基因數(shù)據(jù)庫上提供的人LAMP2基因啟動子序列,設計并合成引物。運用PCR方法,擴增LAMP2基因啟動子的目的片段,測序擴增后序列,參照測序結(jié)果統(tǒng)計分析LAMP2基因序列的變異情況。3根據(jù)野生型、變異型LAMP2基因啟動子序列,通過克隆技術(shù)構(gòu)建pGL3-basic基因重組質(zhì)粒,設pRL-TK為內(nèi)參,將重組質(zhì)粒、p GL3-basic空載體及pRL-TK通過體外脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚腎細胞與大鼠心肌細胞系中。運用Promega基因分析儀,檢測螢火蟲熒光素酶活性、海腎熒光素酶活性,計算兩者比值,探討遺傳變異對LAMP2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性所帶來的影響。結(jié)果:1經(jīng)過測序看圖后總共發(fā)現(xiàn)8個DSVs,其中包含了6個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)。在AMI組人群中,3個SNPs,分別是:g.120469493GT(Rs868454097)、g.120469262TC(Rs1044167843)、g.120469507insG(Rs1192960118),1個雜合DSV:g.120469510AG。在對照組人群中,發(fā)現(xiàn)1個雜合插入的DSV:g.120469183insCTGCCGC CG,1個SNP:g.120469730TC(Rs1395931999)。在AMI組及對照組人群中同時發(fā)現(xiàn)了2個SNPs,分別是:g.120469779AC(Rs42900)、g.120469590TG(Rs28603270)。對比兩組數(shù)據(jù)頻率值,發(fā)現(xiàn)g.120469590TG(Rs28603270)兩組頻率間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),而g.120469779AC(Rs42900)的兩組頻率間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2對LAMP2基因啟動子的pGL3-basic基因載體進行構(gòu)建,分別如下:pGL3-basic(陰性對照)、pGL3-WT(野生型)、pGL3-120469730C、pGL3-120469493T、pGL3-120469510G、pGL3-120469262T、pGL3-120469183insCTGCCGCCG。3通過體外脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293與H9c2中,運用雙熒光報告系統(tǒng),檢測螢火蟲熒光素酶活性、海腎熒光素酶活性,計算兩者比值。只在AMI組中發(fā)現(xiàn)的DSVs顯著影響LAMP2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,其中g(shù).120469493GT(Rs868454097)、g.120469262CT(Rs1044167843)(P0.01)顯著降低了LAMP2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性;g.120469510AG(P0.01)顯著增加了LAMP2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性;只在對照組中發(fā)現(xiàn)的DSVs(g.120469183insCTGCCGCCG、g.120469730TC(Rs1395931999))并未改變LAMP2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.05);同時在AMI組和對照組中DSVs g.120469779AC(Rs42900)、g.120469590TG(Rs28603270)并未改變基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)論:在心肌梗死的病人中,經(jīng)過研究LAMP2基因啟動子的遺傳與變異情況發(fā)現(xiàn):在LAMP2基因啟動子上,其變異序列可能影響了其啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,進而影響了基因的表達。因此,其可能在心肌梗死的發(fā)病過程中起著重要作用,為心肌梗死的發(fā)病機制、診斷、治療及預防提供了新方向。
【圖文】：

圖 1-b LAMP2 基因啟動子擴增片段 2（604bp）。泳道 1-10 為 LAMP2 基因啟動子片段 2 擴增產(chǎn)物，泳道 11 為 D2000 Plus marker。圖-2 AMI 組和正常對照組的 LAMP2 基因（Genebank 收錄號：NG_000023.11）啟動子的 DSVs位置。TSS 位于第一外顯子起始位點 120469169（+1）。-200Exon1-400-600-800g.120469183 insCTGCCGCCGg.120469262T＞Cg.120469493G＞Tg.120469507insGg.120469510A＞Gg.120469590T＞Gg.120469730T＞Cg.120469779A＞C

濟寧醫(yī)學院碩士專業(yè)學位論文61圖-3：AMI 組中發(fā)現(xiàn)的 DSVs 反向測序圖，DSVs g.120469493G>T 、g.120469507insG 和g.120469262T>C，上為野生型，下為雜合型，下為克隆后測序圖譜。箭頭標示為變異位點。
【學位授予單位】：濟寧醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R542.22

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 丁圓;李溪遠;劉玉鵬;宋金青;張堯;王嶠;吳桐菲;李夢秋;秦亞萍;楊艷玲;;Danon病所致肥厚性心肌病LAMP2基因新突變分析[J];中國實用兒科雜志;2014年10期

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1 韓起;分子伴侶自噬（CMA）在乳腺癌血管形成中的作用及其機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2017年

2 吳洪坤;miR-145-3p靶向HDAC4調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡與自噬的作用及機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

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1 蔡維樂;LAMP2參與調(diào)控MRP2在肝細胞膽管側(cè)細胞膜定位的機制研究[D];第四軍醫(yī)大學;2017年

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本文編號：2685988