【摘要】：目的:通過(guò)腺病毒載體上調(diào)和下調(diào)大鼠心肌組織中miR-327的表達(dá),探討其在心肌缺血再灌注損傷(MIRI)中的作用及其分子機(jī)制。方法:(1)腺病毒轉(zhuǎn)染:將60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,分別為假手術(shù)組(Sham組,生理鹽水+假手術(shù))、缺血/再灌注損傷組(I/R組,生理鹽水+I/R)、miR-327抑制組(Ad-miR-327-i組,Ad-miR-327-RNAi+I/R)、腺病毒空載組(Ad-NC組,Ad-EGFP+I/R)和miR-327過(guò)表達(dá)組(Ad-miR-327組,Ad-miR-327+I/R)。Sham組和I/R組心尖多點(diǎn)注射等量生理鹽水,Ad-miR-327-i組、Ad-NC組和Ad-miR-327組心尖多點(diǎn)注射相應(yīng)的腺病毒,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3天后建立大鼠MIRI模型。(2)熒光顯微鏡觀察腺病毒轉(zhuǎn)染效率。(3)建立大鼠MIRI模型:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)缺血30 min,再灌注3 h,Sham組在對(duì)應(yīng)的位置只穿線(xiàn)不結(jié)扎,收集血液和心肌組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。(4)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清心肌酶LDH和CK-MB的含量。(5)TTC染色測(cè)定相對(duì)心肌梗死面積。(6)HE染色評(píng)估心肌組織形態(tài)學(xué)改變。(7)Real-time PCR檢測(cè)miR-327和RP105基因的表達(dá)。(8)Western blot檢測(cè)RP105、TLR4、TLR2、MyD88和NF-κB-p65蛋白的表達(dá)。(9)ELISA檢測(cè)心肌組織中IL-6和TNF-α的含量。(10)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-327與RP105的靶向作用關(guān)系。結(jié)果:(1)腺病毒成功轉(zhuǎn)染至大鼠心肌組織:與注射生理鹽水的Sham組和I/R組相比,Ad-miR-327-i、Ad-miR-327和Ad-NC組心肌組織中有較強(qiáng)的綠色熒光蛋白表達(dá)。(2)成功建立大鼠MIRI模型:與LAD結(jié)扎前相比,結(jié)扎后Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高、T波高聳;與Sham組相比,I/R組心肌酶LDH、CK-MB及心肌梗死面積顯著增加(均P0.05);HE染色示Sham組心肌纖維排列規(guī)則,無(wú)細(xì)胞水腫、肌纖維斷裂及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),I/R組可見(jiàn)心肌纖維排列紊亂、細(xì)胞水腫、肌纖維斷裂及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。(3)下調(diào)miR-327可減輕MIRI:與Ad-NC組相比,Ad-miR-327-i組心肌酶LDH、CK-MB及心肌梗死面積明顯降低,Ad-miR-327組心肌酶LDH、CK-MB及心肌梗死面積明顯升高(均P0.05);HE染色示Ad-NC組心肌纖維排列紊亂、細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),Ad-miR-327-i組的細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)得到改善,Ad-miR-327組心肌損傷加重。(4)下調(diào)miR-327可促進(jìn)RP105的表達(dá):與Sham組相比,I/R組心肌組織中miR-327的表達(dá)明顯增加,RP105的表達(dá)明顯降低(均P0.05);與Ad-NC組相比,Ad-miR-327-i組心肌組織中miR-327的表達(dá)明顯降低,RP105的表達(dá)明顯升高,而Ad-miR-327組心肌組織中miR-327的表達(dá)明顯升高,RP105的表達(dá)明顯降低(均P0.05)。(5)下調(diào)miR-327可抑制TLR4/TLR2-MyD88信號(hào)通路的激活:與Sham組相比,I/R組TLR4、TLR2、MyD88、NF-κB-p65、IL-6和TNF-α的表達(dá)明顯升高(均P0.05);與Ad-NC組相比,Ad-miR-327-i組TLR4、TLR2、MyD88、NF-κB-p65、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著降低,而Ad-miR-327組上述分子的表達(dá)明顯升高(均P0.05)。(6)miR-327靶向作用于RP105的3'UTR:雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,與3'UTR-NC+miR-327組相比,3'UTR+miR-327組的熒光素酶活性明顯降低(P0.05)。結(jié)論:下調(diào)miR-327可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)RP105-TLR4/TLR2-MyD88信號(hào)通路對(duì)MIRI發(fā)揮保護(hù)作用。
【圖文】：

三 峽 大 學(xué) 全 日 制 專(zhuān) 業(yè) 學(xué) 位 碩 士 學(xué) 位 論 文（myeloid differentiation factor, MyD88）和toll樣受體接頭蛋白1（toll-like receptoradaptor molecule 1, TRIF）相互作用，激活MyD88依賴(lài)的和TRIF依賴(lài)的信號(hào)通路，最終促進(jìn)白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[11,13]（圖1）。釋放的炎性細(xì)胞因子，通過(guò)促進(jìn)中性粒細(xì)胞的活化、募集、黏附和浸潤(rùn)，維持炎癥反應(yīng)過(guò)程，進(jìn)一步加重MIRI。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury, IRI）心肌組織中，TLR4、MyD88、NF-κB、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著升高[5,14]，而依立托倫通過(guò)抑制TLR4信號(hào)通路的激活可減輕MIRI[15]。本課題組近期研究也發(fā)現(xiàn)，在IRI心肌組織中，TLR2的表達(dá)升高，TLR2-MyD88信號(hào)通路被激活。因此，以TLR4/TLR2- MyD88信號(hào)通路為切入點(diǎn)，尋找內(nèi)源性干預(yù)因子，可能是防治MIRI的有效靶點(diǎn)。

對(duì)IRI心肌組織發(fā)揮保護(hù)作用。微小RNA（micoRNA, miRNA）包含20-22個(gè)核苷酸序列，可以與目標(biāo)mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3' untranslated region , 3'UTR）堿基配對(duì)結(jié)合，對(duì)目標(biāo)基因發(fā)揮調(diào)控作用（圖2）。多項(xiàng)研究表明，miRNA在MIRI中發(fā)揮重要作用，如miR-15和miR-92a可加重MIRI，而miR-17-3p，miR-210和miR-223在MIRI中發(fā)揮保護(hù)作用[19-23]。也有研究表明，在糖尿病大鼠的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞、IRI心肌組織及IRI腎臟組織中，miR-327表現(xiàn)為2-10倍的升高[24-26]。同時(shí)，Ji等[27]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-327可通過(guò)靶向作用于整合素β3減輕心肌肥厚和心肌纖維化。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IRI心肌組織中升高的miR-327可能對(duì)RP105具有靶向調(diào)控作用。因此，我們推測(cè)IRI心臟組織中上調(diào)的miR-327可能通過(guò)作用于RP105的3'UTR，，抑制RP105的表達(dá)，促進(jìn)TLR4/TLR2信號(hào)通路的活化，進(jìn)而加重MIRI。因此，本課題組擬通過(guò)構(gòu)建可上調(diào)或下調(diào)miR-327表達(dá)的病毒載體，心尖多點(diǎn)注射誘導(dǎo)miR-327在大鼠心肌組織中下調(diào)和過(guò)表達(dá)，探討miR-327對(duì)大鼠MIRI的作用，以及miR-327靶向調(diào)節(jié)RP105-TLR4/TLR2-MyD88信號(hào)通路的分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：三峽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R54

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋歌;呂月濤;狄林林;宗文納;陳伯旺;;早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)重癥肺炎大鼠免疫功能的影響分析[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2017年01期

2 葉敏;陳達(dá)柔;陳宇中;杜少冰;杜展鑫;李玉鳳;唐s鉈

本文編號(hào)：2679409