【摘要】：背景和目的肺血管中膜增厚是肺動脈高壓肺血管重構(gòu)病理改變的重要原因,可由肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMCs)增殖、分泌活性增強(qiáng)而導(dǎo)致。細(xì)胞衰老是以細(xì)胞生長、增殖能力不可逆喪失為主要特征的一個過程。文獻(xiàn)報(bào)道,在慢性阻塞性肺疾病肺血管重構(gòu)中PASMCs衰老顯著增加,但機(jī)制尚未闡明。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低氧處理后,β-半乳糖苷酶染色的陽性細(xì)胞顯著增加以及衰老指標(biāo)p21的表達(dá)顯著上調(diào)。這就表明,低氧可促進(jìn)PASMCs衰老。然而衰老的PASMCs是如何促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖尚不清楚。研究證實(shí),衰老的主動脈平滑肌細(xì)胞通過分泌SASP(IL-1α)促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展;衰老也可上調(diào)主動脈平滑肌細(xì)胞中IL-6的分泌和CCL2的產(chǎn)生,引起慢性炎癥促進(jìn)動脈粥樣硬化。重要的是,在慢性阻塞性肺疾病中PASMCs衰老伴隨IL-6表達(dá)上調(diào),進(jìn)而參與調(diào)節(jié)PASMCs增殖。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):低氧誘導(dǎo)的PASMCs衰老中,伴隨IL-6表達(dá)顯著增高。因此,我們推測在低氧誘導(dǎo)的PASMCs衰老中,衰老的PASMCs可通過旁分泌IL-6促進(jìn)PASMCs增殖,進(jìn)而促進(jìn)PH肺血管重構(gòu)。本課題通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明PASMCs衰老在低氧誘導(dǎo)PH肺血管重構(gòu)中的重要作用并進(jìn)一步驗(yàn)證衰老PASMCs可旁分泌IL-6促進(jìn)PASMCs增殖,導(dǎo)致PH肺血管重構(gòu)。以PASMCs衰老可能是肺動脈高壓肺血管重構(gòu)一種新的病理生理機(jī)制為切入點(diǎn),揭示PASMCs衰老對低氧誘導(dǎo)PH肺血管重構(gòu)的作用。為進(jìn)一步研究如何減輕肺動脈平滑肌細(xì)胞衰老來抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖,進(jìn)而抑制肺動脈高壓肺血管重構(gòu)提供新的策略。方法采用第3代至第8代SD大鼠原代PASMCs,分別在常氧(21%O_2)和低氧(3%O_2)處理48 h,建立PASMCs低氧模型。(1)使用免疫組化法鑒定平滑肌α-肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)。(2)細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性,并計(jì)算陽性率;Western blot檢測衰老指標(biāo)p21、p16蛋白水平,檢測細(xì)胞衰老情況。(3)CCK8檢測PASMCs增殖率;Western blot檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)水平。qPCR法檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)mRNA表達(dá)水平。(4)ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液IL-6旁分泌情況。結(jié)果(1)分離培養(yǎng)的PASMCs,3天后可見PASMCs貼壁生長,形態(tài)呈長梭形,7天后呈典型的“峰-谷”狀生長,10天左右細(xì)胞達(dá)90%以上的融合。在倒置顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析以及免疫組化法的陽性結(jié)果判斷培養(yǎng)的原代細(xì)胞為PASMCs;(2)低氧組(3%O_2)較常氧組相比,細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶陽性率明顯升高(P0.05);衰老指標(biāo)p21、p16蛋白表達(dá)水平明顯增加(P0.05,P0.01);(3)較常氧組相比,低氧組(3%O_2)PASMCs的增殖率增加,PCNA蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P0.05);低氧組(3%O_2)PASMCs中PCNA mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P0.05);(4)低氧組(3%O_2)中細(xì)胞上清液IL-6表達(dá)較常氧組明顯上調(diào)(P0.01);(5)IL-6抑制劑AX-024處理后,細(xì)胞上清液IL-6表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.001),且處理濃度為10 nmoL/mL時(shí)具有最佳抑制作用(P0.05)。結(jié)論1.低氧可誘導(dǎo)PASMCs衰老。2.衰老的PASMCs可通過分泌細(xì)胞因子IL-6促進(jìn)PASMCs增殖。
【圖文】：

PH 肺血管重構(gòu)的影響。即低氧誘導(dǎo) PH 中 PASMCs 的衰老增加，衰老的PASMCs 可通過分泌衰老相關(guān)分泌表型 IL-6 促進(jìn) PASMCs 增殖，從而促進(jìn)PH 肺血管重構(gòu)，為防治 PH 肺血管重構(gòu)提供新的靶點(diǎn)和新的策略（圖1）。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R544.1

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本文編號：2675073