【摘要】：目的采用雌激素膜受體GPR30特異激動劑G1、特異拮抗劑G36為工具藥,研究GPR30激活降低手術絕經大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)神經炎癥損傷的作用,并揭示其可能的分子機制。方法1 SPF級雌性SD大鼠(3月齡)用于本研究。實驗動物行雙側卵巢切除術建立手術絕經模型,并隨機分為假手術組(Sham)、缺血再灌注14d組(Ischemia reperfusion,IR14d)、G1處理組(IR14d+G1)和G36處理組(IR14d+G1+G36)。采用四動脈結扎法制備大鼠全腦缺血模型(Global cerebral ischemia,GCI);2免疫熒光雙染色觀察GPR30等蛋白的細胞定位及蛋白表達水平;3 NeuN(生存神經元細胞核標志蛋白)免疫熒光染色及TUNEL技術觀察海馬CA1區(qū)神經元生存及凋亡情況;4 Western blot(WB)技術檢測NLRP3炎性小體成員等蛋白表達水平;5 G1和G36的給藥方式為切除大鼠卵巢同時皮下埋置微量釋放泵至實驗結束。結果1 GPR30激活降低GCI誘導的海馬CA1區(qū)神經炎癥損傷。GPR30與小膠質細胞標志蛋白Iba1免疫熒光雙染色結果顯示:與sham組相比,IR組Iba1免疫熒光強度顯著增強,并呈現(xiàn)Iba1與GPR30較強的共定位;G1顯著降低Iba1蛋白水平,且少見GPR30與Iba1的共定位;G36顯著逆轉了G1的影響。另外,NeuN免疫熒光染色和TUNEL分析結果顯示:與sham組相比,GCI可誘導海馬CA1區(qū)生存神經元(NeuN陽性染色)數(shù)量顯著減少(P0.05),而凋亡樣細胞(TUNEL陽性染色)顯著增加(P0.05);給予G1后生存神經元數(shù)量顯著增多(P0.05),而凋亡細胞數(shù)量則顯著減少(P0.05),G36可逆轉G1的作用。2GPR30激活降低海馬CA1區(qū)炎性小體成員NLRP3、ASC蛋白表達。WB結果顯示,G1可顯著降低缺血后NLRP3和ASC的蛋白表達水平(P0.05),與Sham組相比無顯著差異(P0.05),而給予G36后NLPR3和ASC的蛋白表達較G1處理組顯著升高(P0.05)。NLRP3/Iba1、ASC/CD11b免疫熒光雙染色結果驗證了WB結果。并且,在IR組和G36處理組海馬CA1區(qū)顯示NLRP3、Iba1蛋白高表達且很強的共定位;同樣,ASC和小膠質細胞標志蛋白CD11b的蛋白表達較G1和Sham組顯著升高且二者高度共定位。3 GPR30激活抑制缺血后海馬CA1區(qū)Caspase1激活(Cle-cas1)。WB結果顯示,G1能夠明顯降低缺血后Cle-cas1的蛋白水平(P0.05),與Sham組相比無顯著差異(P0.05),而給予G36后Cle-cas1水平較G1處理組明顯升高(P0.05)。4 GPR30激活降低缺血后海馬CA1區(qū)IL1β激活(Cle-IL1β)。WB結果顯示,與IR組相比,G1可顯著降低缺血后海馬CA1區(qū)Cle-IL1β蛋白水平(P0.05);而G36處理組較G1處理組Cle-IL1β蛋白水平顯著升高(P0.05)。CD11b與Cle-IL1β的免疫熒光雙染色結果驗證了WB結果;并且可見IR組和G36處理組海馬CA1區(qū)Cle-IL1β與CD11b的免疫共定位。5 GPR30激活上調缺血后海馬CA1區(qū)IL1β受體拮抗劑IL1RA的蛋白水平。WB結果顯示,與IR組相比,G1能夠明顯升高缺血后海馬CA1區(qū)IL1RA的蛋白表達水平(P0.05),而給予G36可逆轉G1對IL1RA蛋白表達的影響,顯著降低了IL1RA蛋白水平(P0.05)。CD11b與IL1RA的免疫熒光雙染色結果驗證了WB結果。IL1RA/NeuN、IL1RA/CD11b免疫熒光雙染色結果顯示,Sham組和G1處理組海馬CA1區(qū)IL1RA表達于NeuN陽性染色細胞(P0.05),而IR組和G36處理組顯示IL1RA主要定位在CD11b陽性染色的小膠質細胞(P0.05)。結論1 GPR30激活降低GCI后海馬CA1區(qū)神經元的炎癥損傷。2 GPR30激活降低GCI后海馬CA1區(qū)NLRP3炎性小體活性。3 GPR30降低全腦缺血后海馬CA1區(qū)神經炎癥損傷的分子機制可能與其上調IL1RA的蛋白水平密切相關。圖19幅;表0個;參184篇。
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541.78

【參考文獻】

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本文編號：2673306