【摘要】：目的采用雌激素膜受體GPR30特異激動(dòng)劑G1、特異拮抗劑G36為工具藥,研究GPR30激活降低手術(shù)絕經(jīng)大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)炎癥損傷的作用,并揭示其可能的分子機(jī)制。方法1 SPF級(jí)雌性SD大鼠(3月齡)用于本研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立手術(shù)絕經(jīng)模型,并隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、缺血再灌注14d組(Ischemia reperfusion,IR14d)、G1處理組(IR14d+G1)和G36處理組(IR14d+G1+G36)。采用四動(dòng)脈結(jié)扎法制備大鼠全腦缺血模型(Global cerebral ischemia,GCI);2免疫熒光雙染色觀察GPR30等蛋白的細(xì)胞定位及蛋白表達(dá)水平;3 NeuN(生存神經(jīng)元細(xì)胞核標(biāo)志蛋白)免疫熒光染色及TUNEL技術(shù)觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元生存及凋亡情況;4 Western blot(WB)技術(shù)檢測(cè)NLRP3炎性小體成員等蛋白表達(dá)水平;5 G1和G36的給藥方式為切除大鼠卵巢同時(shí)皮下埋置微量釋放泵至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。結(jié)果1 GPR30激活降低GCI誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)神經(jīng)炎癥損傷。GPR30與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Iba1免疫熒光雙染色結(jié)果顯示:與sham組相比,IR組Iba1免疫熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),并呈現(xiàn)Iba1與GPR30較強(qiáng)的共定位;G1顯著降低Iba1蛋白水平,且少見(jiàn)GPR30與Iba1的共定位;G36顯著逆轉(zhuǎn)了G1的影響。另外,NeuN免疫熒光染色和TUNEL分析結(jié)果顯示:與sham組相比,GCI可誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)生存神經(jīng)元(NeuN陽(yáng)性染色)數(shù)量顯著減少(P0.05),而凋亡樣細(xì)胞(TUNEL陽(yáng)性染色)顯著增加(P0.05);給予G1后生存神經(jīng)元數(shù)量顯著增多(P0.05),而凋亡細(xì)胞數(shù)量則顯著減少(P0.05),G36可逆轉(zhuǎn)G1的作用。2GPR30激活降低海馬CA1區(qū)炎性小體成員NLRP3、ASC蛋白表達(dá)。WB結(jié)果顯示,G1可顯著降低缺血后NLRP3和ASC的蛋白表達(dá)水平(P0.05),與Sham組相比無(wú)顯著差異(P0.05),而給予G36后NLPR3和ASC的蛋白表達(dá)較G1處理組顯著升高(P0.05)。NLRP3/Iba1、ASC/CD11b免疫熒光雙染色結(jié)果驗(yàn)證了WB結(jié)果。并且,在IR組和G36處理組海馬CA1區(qū)顯示NLRP3、Iba1蛋白高表達(dá)且很強(qiáng)的共定位;同樣,ASC和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD11b的蛋白表達(dá)較G1和Sham組顯著升高且二者高度共定位。3 GPR30激活抑制缺血后海馬CA1區(qū)Caspase1激活(Cle-cas1)。WB結(jié)果顯示,G1能夠明顯降低缺血后Cle-cas1的蛋白水平(P0.05),與Sham組相比無(wú)顯著差異(P0.05),而給予G36后Cle-cas1水平較G1處理組明顯升高(P0.05)。4 GPR30激活降低缺血后海馬CA1區(qū)IL1β激活(Cle-IL1β)。WB結(jié)果顯示,與IR組相比,G1可顯著降低缺血后海馬CA1區(qū)Cle-IL1β蛋白水平(P0.05);而G36處理組較G1處理組Cle-IL1β蛋白水平顯著升高(P0.05)。CD11b與Cle-IL1β的免疫熒光雙染色結(jié)果驗(yàn)證了WB結(jié)果;并且可見(jiàn)IR組和G36處理組海馬CA1區(qū)Cle-IL1β與CD11b的免疫共定位。5 GPR30激活上調(diào)缺血后海馬CA1區(qū)IL1β受體拮抗劑IL1RA的蛋白水平。WB結(jié)果顯示,與IR組相比,G1能夠明顯升高缺血后海馬CA1區(qū)IL1RA的蛋白表達(dá)水平(P0.05),而給予G36可逆轉(zhuǎn)G1對(duì)IL1RA蛋白表達(dá)的影響,顯著降低了IL1RA蛋白水平(P0.05)。CD11b與IL1RA的免疫熒光雙染色結(jié)果驗(yàn)證了WB結(jié)果。IL1RA/NeuN、IL1RA/CD11b免疫熒光雙染色結(jié)果顯示,Sham組和G1處理組海馬CA1區(qū)IL1RA表達(dá)于NeuN陽(yáng)性染色細(xì)胞(P0.05),而IR組和G36處理組顯示IL1RA主要定位在CD11b陽(yáng)性染色的小膠質(zhì)細(xì)胞(P0.05)。結(jié)論1 GPR30激活降低GCI后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的炎癥損傷。2 GPR30激活降低GCI后海馬CA1區(qū)NLRP3炎性小體活性。3 GPR30降低全腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)炎癥損傷的分子機(jī)制可能與其上調(diào)IL1RA的蛋白水平密切相關(guān)。圖19幅;表0個(gè);參184篇。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R541.78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2673306