發(fā)布時(shí)間：2020-05-20 02:15

【摘要】：目的:近年來(lái),在冠脈介入治療及冠脈搭橋術(shù)、心臟外科體外循環(huán)等治療中,許多組織器官缺血后重新得到血液再灌注。多數(shù)情況下,缺血后再灌注可使組織器官功能得到恢復(fù),損傷的結(jié)構(gòu)得到修復(fù),患者病情好轉(zhuǎn)康復(fù);但是有時(shí)在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷反而加重,甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制尚未徹底闡明。目前認(rèn)為活性氧自由基的作用是缺血-再灌注損傷的重要發(fā)病學(xué)環(huán)節(jié)。在體外實(shí)驗(yàn)中,可以使用H_2O_2刺激大鼠乳鼠心肌細(xì)胞來(lái)模擬活性氧損傷。MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性的非編碼RNA,它們能夠通過(guò)與其靶基因mRNA的3’UTR區(qū)互補(bǔ),在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制它們靶基因的翻譯。microRNA-208a(miR-208a)是一個(gè)在心肌中特異性表達(dá)的microRNA,種屬間高度保守。因此推測(cè),miR-208a具有如此高的心肌特異性,必定與心肌的特性有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道,心肌梗死患者的血漿中,miR-208a的表達(dá)量明顯增高。活性氧自由基生成增加產(chǎn)生的氧化應(yīng)激以及由氧化應(yīng)激觸發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡,是多種原因誘導(dǎo)的缺血-再灌注發(fā)生發(fā)展的共同基礎(chǔ)。此外,在心肌缺血/再灌注損傷中,miR-208的表達(dá)量也有改變。在心肌缺血/再灌注損傷中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基,從而引起心肌細(xì)胞凋亡,加重心肌損傷。細(xì)胞凋亡是心肌缺血/再灌注損傷的病理特征之一,而且是損傷早期的主要死亡方式。因此,本課題主要探究miR-208a在心肌中保持如此高的表達(dá)量的原因,以及其生物學(xué)功能和潛在的分子生物學(xué)機(jī)制。方法:(1)首先,構(gòu)建大鼠心臟缺血再灌注模型,再灌注損傷后取損傷處心臟組織以及損傷遠(yuǎn)端處心臟組織,使用組織研磨器將組織塊研磨為細(xì)胞勻漿,再利用qRT-PCR的方法對(duì)miR-208a的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。為了檢查miR-208a在細(xì)胞對(duì)H_2O_2刺激的反應(yīng)中的作用,用不同濃度的H_2O_2處理了心肌細(xì)胞。再利用qRT-PCR的方法對(duì)miR-208a的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。為了研究miR-208a是否參與ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,通過(guò)用化學(xué)合成的miR-208a模擬物(miR-208 Mimic)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞以增強(qiáng)內(nèi)源性miR-208a功能;或用化學(xué)合成的片段與miR-208a(miR-208a KD)的反向互補(bǔ)序列減弱內(nèi)源性miR-208a效應(yīng),來(lái)建立過(guò)表達(dá)和敲低系統(tǒng)。(2)成功分離并培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞用于機(jī)理研究。使用將外源性H_2O_2加入到培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中,并在miR-208a過(guò)表達(dá)或敲低體系中,通過(guò)熒光染料CM-H2DCFDA檢測(cè)到ROS水平。此外,使用ELISA測(cè)定用于檢測(cè)培養(yǎng)基中超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的分泌水平。(3)通過(guò)FITC-Annexin V/PI染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)改變miR-208a的表達(dá)是否可以阻止H_2O_2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。并且還檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白標(biāo)記物的活性,即凋亡標(biāo)記蛋白caspase-3和PARP在H_2O_2處理的心肌細(xì)胞中的切割活性(4)通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析尋找miR-208a的潛在靶標(biāo),并且使用western blot法檢測(cè)H_2O_2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中潛在靶標(biāo)的表達(dá)趨勢(shì)是否與miR-208a相關(guān)。此外,將含有miR-208a結(jié)合位點(diǎn)的靶標(biāo)的3'UTR克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pmiR-REPORT Luciferase載體中,并使用熒光素酶報(bào)告技術(shù)驗(yàn)證潛在靶標(biāo)是否確實(shí)為miR-208a的靶標(biāo)。(5)為了闡明PTPRG和PTPN4在心肌細(xì)胞中的生物學(xué)功能,分別用過(guò)表達(dá)PTPRG或PTPN4的腺病毒感染心肌細(xì)胞,并使用western blot的方法進(jìn)行了確認(rèn),FITC-Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。使用siRNA對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行敲低,并在心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-208a抑制劑,然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,同時(shí)使用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)基中SOD和CAT的分泌水平。結(jié)果:(1)在I/R刺激后觀察到miR-208a mRNA水平的明顯下調(diào),然而,α-MHC的變化沒(méi)有顯著性。將心肌細(xì)胞暴露于不同濃度的H_2O_2處理6小時(shí),發(fā)現(xiàn)H_2O_2導(dǎo)致心肌細(xì)胞中miR-208a的表達(dá)降低。為了研究miR-208a是否參與ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,構(gòu)建了miR-208a的過(guò)表達(dá)或敲低體系,并使用qPCR進(jìn)行了驗(yàn)證。(2)將外源性H_2O_2加入到培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中,檢測(cè)到高水平的ROS。miR-208a過(guò)表達(dá)時(shí)ROS水平幾乎沒(méi)有變化,然而,當(dāng)miR-208a在心肌細(xì)胞中被敲低時(shí),檢測(cè)到ROS水平顯著降低時(shí)。同時(shí),ELISA結(jié)果表明miR-208a敲低組中SOD和CAT水平均增加。(3)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-208a的敲低可以顯著降低H_2O_2誘導(dǎo)的發(fā)生率,miR-208a的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Western blot結(jié)果顯示miR-208a敲低顯著減輕了PARP和caspase-3的切割,而miR-208a模擬顯著增強(qiáng)了caspase-3和PARP切割活性(4)使用Targetscan在線軟件(http://www.targetscan.org)預(yù)測(cè)得到3個(gè)PTP,PTPRG,PTPDC1和PTPN4是miR-208a的潛在靶標(biāo)。最重要的是,當(dāng)測(cè)試用400μMH2O2處理的培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中miR-208a和靶基因的表達(dá)水平時(shí),發(fā)現(xiàn)miR-208a和PTPRG與PTPN4之間存在顯著的負(fù)相關(guān)。通過(guò)操縱miR-208a在心肌細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-208a過(guò)表達(dá)可以下調(diào)PTPRG和PTPN4的蛋白水平,而miR-208a的敲低可以增加PTPRG和PTPN4的蛋白水平。在與熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和miR-208a Mimics或Scramble共轉(zhuǎn)染后,發(fā)現(xiàn)miR-208a的上調(diào)分別顯著降低了野生型PTPRG 3'UTR和PTPN4 3'UTR的熒光素酶活性,然而,當(dāng)野生型PTPRG 3'UTR和PTPN4 3'UTR改變?yōu)橥蛔働TPRG 3'UTR和PTPN43'UTR時(shí),這種現(xiàn)象明顯逆轉(zhuǎn)。(5)通過(guò)Western印跡分析,發(fā)現(xiàn)腺病毒轉(zhuǎn)染后,PTPRG和PTPN4蛋白水平顯著上調(diào)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示PTPRG和PTPN4有助于抑制心肌細(xì)胞凋亡,并可逆轉(zhuǎn)miR-208過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的促凋亡作用,同時(shí),兩種基因的敲低可以逆轉(zhuǎn)miR-208a抑制劑誘導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用。通過(guò)拯救實(shí)驗(yàn),解釋了抗miR-208a可以通過(guò)上調(diào)內(nèi)源性PTPRG和PTPN4蛋白水平來(lái)降低ROS水平并抑制細(xì)胞凋亡率。最后,證實(shí)當(dāng)PTPCG和PTPN4過(guò)表達(dá)時(shí),培養(yǎng)基中SOD和CAT的分泌水平增加,而相反,當(dāng)PTPCG和PTPN4時(shí),SOD和CAT的分泌水平降低。結(jié)論:在本研究中,報(bào)告了miR-208a在心肌I/R損傷中的作用以及潛在的心臟保護(hù)機(jī)制。內(nèi)源性miR-208a的敲低顯著降低了細(xì)胞ROS水平并降低了心肌細(xì)胞凋亡,外源性miR-208a過(guò)表達(dá)可增加心肌細(xì)胞的ROS水平,并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。此外,PTPRG和PTPN4參與調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸化平衡水平,通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)以及熒光素酶報(bào)告技術(shù),驗(yàn)證PTPRG和PTPN4為的miR-208a靶基因�？傊�,研究表明miR-208a在ROS誘導(dǎo)的心臟細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵的保護(hù)作用。
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果肌細(xì)胞中 miR-208a 的表達(dá)建 I / R 動(dòng)物模型，然后進(jìn)行 qRT-PCR 測(cè)定表達(dá)水平。如圖 1 所示，在 I / R 刺激后觀察然而，α-MHC 的變化沒(méi)有顯著性。

在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中使用不同濃度的 H2O2處理，通過(guò) qR-208a 的表達(dá)水平。*，與對(duì)照相比 p <0.05。研究 miR-208a 是否參與 ROS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，通過(guò)用化學(xué) 模擬物（miR-208a Mimic）轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞以增強(qiáng)內(nèi)源性 miR-20合成的 miR-208a（miR-208a KD）的互補(bǔ)序列減弱內(nèi)源 miR-208達(dá)和敲低系統(tǒng)，試驗(yàn)中使用亂序的 22-nt miRNA（Scramble）作為顯示過(guò)表達(dá)或敲低功效是成功有效的。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2671863